Un nuovo fly-through del cervello della mosca consente a chiunque di sfrecciare oltre i neuroni e visitare una qualsiasi delle 40 milioni di sinapsi in cui i neuroni toccano il neurone. È una visione ad alta risoluzione delle complesse connessioni di rete nel cervello dell'insetto che sono alla base dei comportamenti che vanno dall'alimentazione all'accoppiamento.

Cosa c'è di senza precedenti, però, è che questa mappa 3D su tutto il cervello della mosca, che mostra dettagli di soli 60 nanometri di diametro, fu catturato in meno di tre giorni.

Anche se il livello di dettaglio non è così buono come quello ottenuto con un microscopio elettronico, gli sforzi per mappare completamente i neuroni e le sinapsi del cervello di mosca con EM hanno richiesto 10 anni e gli sforzi di dozzine di persone. La nuova mappa è stata ottenuta mille volte più velocemente combinando due tecniche all'avanguardia, microscopia ad espansione e microscopia a foglio di luce reticolare.

Una mappa in scala fine dell'intera rete neurale del cervello, il cervello umano ma anche quello del topo e della mosca, è stato per decenni il sogno dei neuroscienziati. Con esso, potrebbero tracciare le connessioni tra i neuroni per capire come il cervello prende le decisioni. E contando le sinapsi, i neuroscienziati potrebbero giudicare la forza delle connessioni neurali, come i responsabili della memoria.

La nuova e più veloce tecnica di imaging dell'intero cervello aiuterà gli scienziati a scoprire i circuiti neurali delle mosche che alla fine sono anche alla base del funzionamento del cervello umano. E funziona ugualmente bene per mappare i circuiti neurali in piccoli pezzi del cervello del topo, e potenzialmente il cervello umano.

"Puoi passare anni e anni a ottenere un'immagine EM di un cervello di mosca, " disse il premio Nobel Eric Betzig, che ha inventato il microscopio a foglio di luce reticolare mentre era al Janelia Research Campus dell'Howard Hughes Medical Institute ed è ora professore di biologia molecolare e cellulare e di fisica all'Università della California, Berkeley. "Posso vederci arrivare al punto di acquisire immagini di almeno 10 cervelli di mosca al giorno".

Tale velocità e risoluzione consentirà agli scienziati di porre nuove domande, Egli ha detto, come il modo in cui i cervelli differiscono tra maschi e femmine, o come i circuiti cerebrali variano tra mosche dello stesso tipo.

"Abbiamo superato una soglia nelle prestazioni di imaging, ", ha affermato Edward Boyden del Massachusetts Institute of Technology, che ha inventato la microscopia ad espansione cinque anni fa. "Ecco perché siamo così eccitati. Non stiamo solo scansionando in modo incrementale più tessuto cerebrale, stiamo scansionando interi cervelli."

Betzig, Boyden e i loro team pubblicheranno i loro risultati questa settimana sulla rivista Scienza .

Combinazione di espansione e microscopia a foglio leggero

La nuova tecnica di scansione del cervello è nata dopo che Boyden ha chiesto l'aiuto di Betzig per combinare la microscopia ad espansione con l'ultima tecnica di imaging ad alta velocità di Betzig, microscopia reticolare a foglio leggero. La microscopia ad espansione (ExM) comporta il fissaggio del tessuto e quindi l'espansione come un palloncino mantenendo invariate le posizioni relative delle strutture interne. Usa un gel di poliacrilammide come quello dei pannolini, che si gonfia quando viene spostato dall'acqua salata all'acqua pura. La microscopia a foglio di luce reticolare (LLSM) utilizza fasci di luce altamente focalizzati per assemblare rapidamente un'immagine 3D di un campione una fetta sottile alla volta.

"Quando sono venuti da me per la prima volta nel 2016, Ero ancora scettico; Ero preoccupato, primo, se potessi espandere qualcosa del genere e non farlo deformare come un matto, " Betzig ha detto. "E poi ho avuto paura che, mentre i campioni sono trasparenti, distorcerebbero ancora la luce come un sacco di biglie."

Lavorando al campus Janelia, le squadre combinate, guidato dai postdoc Ruixuan Gao e Shoh Asano del laboratorio del MIT di Boyden e Srigokul Upadhyayula della Harvard Medical School, scoperto che dopo aver espanso il tessuto cerebrale di un fattore quattro, a un volume 64 volte normale, era quasi chiaro come l'acqua e non deformato.

"Sono rimasto scioccato da quanto fosse perfetta la radura per renderla incredibilmente uniforme dal punto di vista ottico, " Egli ha detto.

Di conseguenza, il microscopio a foglio di luce reticolare è stato in grado di produrre un'immagine altamente dettagliata e precisa del cervello a livello delle singole sinapsi:una risoluzione di circa 60 nanometri, che è solo un decimo della risoluzione di EM. L'imaging multicolore ha richiesto solo 62,5 ore.

I team hanno testato la tecnica ExLLSM non solo sull'intero cervello del moscerino della frutta, ma anche su una scheggia di cervello di topo che attraversa la corteccia spessa un millimetro, con risultati simili. Sono stati in grado di contare tutte le sinapsi nel cervello della mosca, per un totale di circa 40 milioni. Il cervello umano, con 80 miliardi di neuroni e forse 7, 000 sinapsi per neurone, sarebbe molto più impegnativo.

Betzig prevede, però, che con miglioramenti nella microscopia ad espansione - alcuni scienziati hanno allungato il tessuto 25 volte in ogni direzione - le tecniche combinate potrebbero ottenere risultati quasi buoni quanto l'EM in termini di mappatura di tutte le connessioni neurali nel cervello, un campo noto come connettomica.

"Se potessi farlo funzionare a 10 volte o forse 15 volte l'espansione, potresti probabilmente far fallire molti ME, "Ha detto. "Potrebbe essere abbastanza buono fare il denso tracciamento neurale che può fare EM, ma molto molto più veloce ed economico. Penso che debbano guardarsi le spalle. non c'è ancora, ma secondo me il potenziale c'è".

Microscopia a fluorescenza

Entrambe le tecniche al microscopio comportano l'etichettatura delle proteine ​​nel tessuto con marcatori fluorescenti. Nella microscopia ad espansione, il tessuto viene quindi infuso con il gel e i marcatori reticolati alla struttura del gel. Quindi tutte le proteine ​​vengono digerite, lasciando quello che Betzig definisce un "fantasma fluorescente". La modifica della concentrazione salina del supporto provoca il rigonfiamento del gel, trascinando con sé i marcatori. diventa per lo più acqua, che ne spiega la chiarezza.

Boyden originariamente utilizzava la microscopia ottica confocale per visualizzare il tessuto espanso, ma sperava che LLSM avrebbe ripreso l'immagine del campione più velocemente e con una risoluzione ancora migliore, superando anche la completa perdita del segnale di fluorescenza che si verifica durante l'imaging in profondità all'interno di campioni spessi con mezzi convenzionali. LLSM scansiona uno strato di luce stretto fino a 400 nanometri, piano per piano attraverso il campione, imaging della fluorescenza dai marker in ciascun piano illuminato

Ogni scansione completa, pari a quasi 10 terabyte di dati, viene poi assemblato dal computer in un'immagine 3D che può essere navigata come un videogioco. L'assemblea che richiede molto tempo è stata supervisionata dagli scienziati informatici di Janelia Stefan Saalfeld e Igor Pisarev, e poi analizzato e visualizzato da Upadhyayula, che presto aprirà un laboratorio di imaging all'avanguardia alla UC Berkeley.

Attaccando marcatori fluorescenti a uno qualsiasi dei 10, 000 proteine ​​nel cervello, dovrebbe essere possibile mappare le membrane esterne dei neuroni e di altre cellule, le sinapsi in cui un neurone si connette con un altro, i compartimenti interni delle cellule cerebrali, e altro ancora.

Ci sono limitazioni, però. Come con qualsiasi tipo di microscopia a fluorescenza a super risoluzione, Betzig ha detto, può essere difficile decorare le proteine ​​con abbastanza lampadine fluorescenti per vederle chiaramente ad alta risoluzione. E poiché la microscopia ad espansione richiede molti passaggi di elaborazione, c'è ancora il potenziale per l'introduzione di artefatti. A causa di ciò, Egli ha detto, "abbiamo lavorato molto duramente per convalidare ciò che abbiamo fatto, e altri farebbero bene a fare lo stesso".