Meccanismo di funzionamento della piattaforma centrifuga acustofluidica. (A) Illustrazione del sistema di centrifuga acustofluidica. La gocciolina viene posizionata su un anello PDMS che confina il confine del fluido e si trova tra due IDT inclinati. Mentre le SAW si propagano nella gocciolina, l'interfaccia liquido-aria è deformata dalla pressione di radiazione acustica, e la goccia inizia a girare. Le particelle all'interno della gocciolina seguiranno traiettorie elicoidali (inset) sotto l'influenza sia del flusso di vortici indotto che della gocciolina rotante. (B) Una sequenza di immagini che mostrano la vista laterale di una gocciolina rotante da 30 microlitri. Il SAW si attiva a 0 s. La sequenza mostra che quando la goccia inizia a girare, si allunga a forma di ellissoide concava, come illustrato in (A). La freccia gialla indica la posizione di riferimento che ruota insieme alla goccia rotante. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.abc0467
Le goccioline liquide hanno recentemente guadagnato una rinnovata attenzione come modello semplificato per una varietà di affascinanti fenomeni fisici su scala dal nucleo cellulare ai buchi neri stellari. In un nuovo rapporto ora pubblicato in Progressi scientifici , Yuyang Gu e un team di scienziati negli Stati Uniti hanno presentato una tecnica di centrifugazione acustofluidica che utilizzava l'entanglement dell'attivazione dell'onda acustica e la rotazione di una gocciolina fluidica per ottenere l'arricchimento e la separazione delle nanoparticelle. Hanno combinato la scansione acustica e i metodi di filatura delle goccioline per ottenere concentrazioni rapide di nanoparticelle e una separazione basata sulle dimensioni con una risoluzione sufficiente per identificare e isolare le sottopopolazioni di esosomi.
Gli esosomi sono vescicole extracellulari su scala nanometrica che possono trasportare carichi molecolari da cellula a cellula e sono quindi un potente vettore/veicolo nella ricerca biomedica per la somministrazione di farmaci e le applicazioni di scoperta biomolecolare. Il team ha caratterizzato i meccanismi alla base del processo sia numericamente che sperimentalmente, oltre alla capacità di elaborare campioni biologici all'interno dei dispositivi. Il metodo della centrifuga acustofluidica ha superato i limiti esistenti della manipolazione delle bioparticelle su nanoscala in campi multidisciplinari della biologia, chimica, ingegneria, scienza dei materiali e medicina.
Il sistema a centrifuga austofluidico
Gli scienziati dei materiali mirano a manipolare le nanoparticelle per una varietà di applicazioni biomediche e biochimiche, tra cui la somministrazione di geni o farmaci, saggi biologici, diagnostica e reazioni catalitiche. È quindi necessario eseguire le fasi di concentrazione o separazione di nanoparticelle per applicazioni di nanostrutture in campi multidisciplinari. L'acustofluidica mira a combinare l'acustica e la microfluidica per un design del dispositivo semplicistico. In questo lavoro, Gu et al. ha presentato un sistema di centrifuga acustofluidica per manipolare acusticamente particelle con dimensioni fino a pochi nanometri. Il metodo ha consentito varie funzioni tra cui la concentrazione di nanoparticelle, separazione e trasporto.
Il sistema di base conteneva una coppia di trasduttori interdigitali inclinati (IDT) e un anello circolare in polidimetilsilossano (PDMS) per incapsulare una porzione della gocciolina e definirne la forma. Il team ha generato onde acustiche di superficie (SAW) per avviare il movimento rotatorio delle goccioline. Il processo ha permesso a Stokes di spostarsi lungo un percorso circolare chiuso per trasferire la quantità di moto del fluido per aumentare notevolmente la velocità di flusso interno e la velocità di taglio all'interno della goccia di molte pieghe. Secondo simulazioni numeriche, le onde acustiche potrebbero ruotare una goccia di liquido con un volume di campione variabile per influenzare le nanoparticelle di varie dimensioni che risiedono all'interno della goccia. Il team prevede di tradurre il lavoro su scala micro/nano per semplificare il processo di trasfezione per automatizzare il caricamento del carico di vescicole e accelerare le biopsie liquide.
Caratterizzazione dello spin delle goccioline e del movimento delle particelle nel dispositivo a centrifuga austofluidico. (A) Una sequenza di immagini che mostrano la vista dall'alto di una gocciolina rotante al microscopio. (B) Sequenza temporale corrispondente di immagini impilate lungo la linea a-a′, che mostra la rotazione periodica della gocciolina ellissoide. (C) La velocità istantanea in un punto sulla gocciolina rotante può essere estratta da questo adattamento normalizzato della variazione della distanza rispetto al tempo (B). (D) Velocità di rotazione della goccia teorica e sperimentale [rotazioni al minuto (RPM)] rispetto alla variazione del raggio della goccia. Il volume (V) della gocciolina si riferisce al volume sopra l'anello PDMS. (E) Traiettorie delle particelle calcolate in teoria e (F) osservate sperimentalmente che mostrano le modalità di doppia rotazione; le particelle tracciano un percorso elicoidale mentre si avvicinano al centro della gocciolina ruotando anche attorno ai loro assi locali. Barra della scala, 500 micron. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.abc0467 
Gu et al. ha posizionato una goccia su un anello PDMS per confinare il confine del fluido e lo ha posizionato tra due trasduttori interdigitali inclinati (IDT). Hanno quindi applicato un segnale elettrico agli IDT inclinati per generare due onde acustiche di superficie che si propagano lungo il substrato da due direzioni opposte per entrare nella gocciolina. Il processo ha deformato l'interfaccia liquido-aria a causa della pressione della radiazione acustica e le goccioline hanno iniziato a ruotare. Le particelle all'interno della gocciolina hanno seguito traiettorie elicoidali a causa dell'influenza del flusso di vortici indotto e dei movimenti di rotazione delle goccioline. Gli scienziati hanno ottenuto una sequenza di immagini per mostrare la vista laterale di una gocciolina rotante di 30 µl. Hanno calcolato la velocità di rotazione della gocciolina rotante utilizzando una trasformata di Fourier della forma d'onda e hanno estratto la velocità della gocciolina dalla forma d'onda e hanno confrontato la velocità di rotazione con le classiche dinamiche di oscillazione delle goccioline.
Arricchimento rapido di nanoparticelle tramite centrifuga acustofluidica. (A) Traiettoria di particelle simulata numericamente all'interno di una gocciolina rotante. Quando la goccia inizia a girare, le particelle che inizialmente erano distribuite casualmente all'interno della gocciolina (a sinistra) seguono una traiettoria elicoidale fino a concentrarsi al centro della gocciolina (a destra). (B) Immagini in fluorescenza prima (sinistra) e dopo (destra) l'attivazione del campo acustico, che mostra l'arricchimento di particelle PS a 28 nm. Barra della scala, 50 micron. (C) Velocità di streaming con (risultato sperimentale) e senza (risultato della simulazione) rotazione delle goccioline. (D) Grafico della velocità di taglio media calcolata all'interno della goccia rispetto alla velocità. La velocità di taglio aumenta con una velocità di rotazione più elevata e aumenta di parecchie volte rispetto alla velocità di taglio in assenza di goccioline rotanti (solo flusso). (E) Diagramma di flusso che mostra il processo di arricchimento del DNA e miglioramento del segnale fluorescente in una gocciolina rotante. (F) Grafico dell'intensità di fluorescenza del DNA misurata rispetto al tempo nella gocciolina rotante. Riquadri:immagini in fluorescenza prima e dopo il miglioramento del segnale. Barra della scala, 50 micron. a.u., unità arbitrarie. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.abc0467
La cinetica delle goccioline e delle nanoparticelle all'interno del dispositivo
Il team ha quindi studiato lo spin delle goccioline e il movimento delle particelle nel dispositivo a centrifuga acustofluidica utilizzando una sequenza di immagini. Le particelle hanno mostrato due modalità di rotazione, tracciando un percorso elicoidale quando si avvicinavano al centro della gocciolina mentre ruotavano anche attorno ai loro assi locali. Hanno usato una gamma di frequenze per eccitare la rotazione delle goccioline. All'aumentare della potenza applicata, la goccia ha mantenuto la sua forma di equilibrio e quindi ha iniziato a subire piccole oscillazioni fino a quando la potenza acustica ha raggiunto un valore di soglia, a quel punto la gocciolina è entrata in rotazione stabile. Studi precedenti hanno mostrato come le SAW (onde acustiche di superficie) inducono vortici di flusso acustico all'interno di una gocciolina, perciò, il team ha analizzato il movimento delle particelle all'interno della gocciolina rotante. Durante gli esperimenti, le nanoparticelle si sono mosse lungo traiettorie elicoidali corrispondenti ad un effetto di deriva di Stokes. Hanno monitorato il movimento di particelle da 1 µm con una telecamera veloce e hanno analizzato i video utilizzando la velocimetria di tracciamento delle particelle per osservare le traiettorie a forma elicoidale seguite dalle particelle. Ad ogni rotazione della goccia, le particelle hanno compiuto una rotazione locale mentre simultaneamente si avvicinavano al centro globale della goccia lungo il suo percorso elicoidale. In questo modo, il processo ha spinto le particelle verso l'interno per concentrare le nanoparticelle al centro della gocciolina.
Concentrazione differenziale di nanoparticelle tramite centrifuga acustofluidica. (A) Risultati della simulazione numerica che mostrano la differenza nelle traiettorie delle nanoparticelle per particelle con dimensioni di 100 nm (rosso) e 28 nm (blu). Mentre le particelle da 100 nm si concentrano al centro della gocciolina rotante, le particelle di 28 nm seguono una traiettoria elicoidale ma rimangono distribuite casualmente in tutta la gocciolina. GFP, proteina fluorescente verde. (B, C) Immagini al microscopio che mostrano il risultato sperimentale della separazione delle particelle con particelle da 100- (C) e 28-nm (B). Barra della scala, 100 micron. (D) Intensità di fluorescenza lungo l'asse della gocciolina che mostra l'effetto di concentrazione sulle particelle da 100 nm. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.abc0467
Arricchimento rapido di nanoparticelle
Utilizzando indagini numeriche e sperimentali, il team ha mostrato come le nanoparticelle potrebbero essere rapidamente concentrate all'interno della gocciolina rotante con dimensioni delle particelle di appena 28 nm di diametro. La rapida concentrazione di nanoparticelle potrebbe anche facilitare il rilevamento di campioni biologici contrassegnati in modo fluorescente come molecole di DNA, quale Gu et al. dimostrato in questo lavoro. Il team ha utilizzato un colorante fluorescente per rilevare i campioni di DNA all'interno della gocciolina, e ha generato un segnale acustico per la rotazione delle goccioline. Hanno ottenuto l'amplificazione del segnale e una migliore rilevazione del segnale in base alla concentrazione di DNA nel campione. A parte il rapido arricchimento di nanoparticelle, il sistema ha anche concentrato in modo differenziale nanoparticelle di varie dimensioni. Per esempio, l'interazione di parametri acustici tra cui frequenza e ampiezza, e le dimensioni delle goccioline hanno generato traiettorie di particelle diverse all'interno della stessa gocciolina. Però, la scala temporale e la velocità di migrazione per raggiungere una posizione specifica variavano per le particelle all'interno della stessa gocciolina. Ad esempio, quando nanoparticelle di due diverse dimensioni erano contenute all'interno di una gocciolina rotante, le particelle più grandi hanno sperimentato maggiori forze di radiazione acustica ed effetti minori dal moto browniano.
Separazione e trasporto delle particelle tramite centrifuga acustofluidica a doppia goccia. (A) Schema della centrifuga acustofluidica a doppia goccia. Questa funzionalità a doppia goccia si ottiene utilizzando la codifica binaria a spostamento di frequenza, che comporta lo spostamento sequenziale tra due frequenze per ogni IDT. Con un'alta frequenza di spostamento, due goccioline possono essere ruotate contemporaneamente. Le due goccioline sono collegate da un microcanale, che funge da passaggio per il trasporto di particelle. Qui, le frequenze specifiche sono 15,3 MHz (f4), 15,7 MHz (f3), 20,3 MHz (f2), e 21,7 MHz (f1), con una frequenza di spostamento di 100 kHz. (B) Un'immagine composita che mostra la traiettoria delle particelle attraverso il canale centrale. (C) La trasformata di Fourier del grafico della forma d'onda di un punto fisso sulla gocciolina mentre ruota, indicando la frequenza di rotazione di picco delle due goccioline con volumi diversi. (D) Sequenza di immagini che mostra la vista dall'alto della centrifuga acustofluidica a doppia goccia. Immagini in fluorescenza (E) prima e (F) dopo l'attivazione del segnale acustico, che mostra la separazione delle nanoparticelle e il trasporto da una gocciolina all'altra. Riquadro:Immagine a fluorescenza del canale centrale che indica il processo di trasporto delle particelle. (G) Confronto della distribuzione della dimensione delle particelle tra i campioni pre e post-separazione. Il campione originale, che è stato posto nella goccia giusta, ha due picchi a 28 e 100 nm. Dopo la separazione, la maggior parte delle particelle di 28 nm sono state separate e sono state trasportate nella gocciolina sinistra, che ha un solo picco a 28 nm. Barre della scala, 200 micron. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.abc0467 
Un dispositivo a singola goccia potrebbe anche influenzare negativamente la purezza dei sottoinsiemi di nanoparticelle contenute al loro interno durante i processi di concentrazione differenziale e recupero; perciò, Gu et al. ha sviluppato una centrifuga acustofluidica a doppia goccia per la separazione pratica delle nanoparticelle. Utilizzando il dispositivo, hanno eccitato due coppie di onde acustiche di superficie (SAW) per propagarsi asimmetricamente attraverso i fianchi delle due goccioline per causare spin simultanei per generare due fasci acustici tramite un singolo trasduttore interdigitale. Il team ha utilizzato un key shift di frequenza per passare tra due diverse frequenze di eccitazione e posizioni di eccitazione, con applicazioni pratiche per la separazione di sottopopolazioni esosomiali. Il metodo ha consentito il frazionamento rapido dei campioni di esosomi in diverse sottopopolazioni per le misurazioni tramite l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
In questo modo, Yuyang Gu e colleghi hanno sviluppato e dimostrato una piattaforma di centrifuga acustofluidica per arricchire o separare in modo efficiente e rapido bioparticelle su nanoscala. Questa piattaforma può semplificare sostanzialmente la velocità di elaborazione del campione, rilevamento e reazioni dei reagenti in varie applicazioni, tra cui la diagnostica point-of-care, saggi biologici e biomedicina.
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