La membrana che racchiude una cellula biologica non è semplicemente una barriera; è pieno zeppo di proteine coinvolte in tutti i tipi di funzioni biologiche critiche. Per capire veramente cosa fanno e come fanno le proteine di membrana, i ricercatori devono sapere come sono organizzate e come interagiscono tra loro. Ma scoprire queste informazioni è impegnativo.
I ricercatori di Yale hanno ora sviluppato un nuovo metodo di microscopia chiamato Native-nanoBleach che supera le principali sfide per comprendere l’organizzazione delle proteine di membrana, inclusa la difficoltà nello studiare queste membrane senza disturbare l’ambiente nativo e i limiti alla risoluzione dei microscopi ottici tipicamente utilizzati per studiarle.
E per dimostrare l'efficacia del nuovo metodo, lo hanno applicato con successo a un enigma biologico, relativo alle proteine coinvolte nello sviluppo dei tumori del pancreas e al modo in cui potrebbero essere oggetto di trattamento, rimasto irrisolto per decenni.
Descrivono il nuovo metodo e i suoi vantaggi in un nuovo studio pubblicato su Nature Nanotechnology .
I metodi tipicamente utilizzati nello studio dell'organizzazione delle proteine di membrana richiedono la rimozione dell'ambiente nativo della membrana che circonda le proteine e quindi l'inserimento delle proteine isolate di interesse in ambienti che imitano ma non replicano completamente la complessità della membrana cellulare reale, ha affermato Moitrayee Bhattacharyya, assistente professore di farmacologia presso la Yale School of Medicine e autore senior dello studio. Questo approccio, ha detto Bhattacharyya, rimuove il contesto importante poiché le proteine interagiscono con le molecole che le circondano.
In secondo luogo, i microscopi ottici, comunemente utilizzati per osservare l'organizzazione delle proteine, non hanno la risoluzione necessaria per determinare se le proteine vicine interagiscono veramente o sono semplicemente vicine sulle membrane.
Infine, la quantità di una particolare proteina presente nella membrana cellulare potrebbe essere troppo bassa o troppo alta per gli attuali metodi di studio. In questi casi, i ricercatori devono apportare modifiche; devono replicare le proteine che nel loro stato naturale sono troppo poche o separare le proteine dai campioni dove ce ne sono troppe. Ma anche questo può rimuovere un contesto importante sullo stato naturale delle proteine mentre si trovano e funzionano nelle membrane cellulari.
"Idealmente, avremmo un metodo che funzioni con qualsiasi livello endogeno di espressione proteica della membrana cellulare", ha affermato Bhattacharyya.
Per affrontare la prima sfida, i ricercatori hanno utilizzato particolari molecole, tipi di polimeri, per estrarre essenzialmente i complessi proteici con la membrana cellulare circostante intatta. "È come se la membrana cellulare fosse un foglio di pasta per biscotti e i polimeri fossero stampini per biscotti", ha detto Bhattacharyya.
Questi pezzetti di proteina circondati dalla membrana cellulare, chiamati nanodischi nativi, hanno un diametro di circa 10 nanometri, abbastanza piccoli da far sì che qualsiasi proteina contenuta nel nanodisco possa interagire, il che affronta la seconda sfida. Inoltre, questo approccio funziona con qualsiasi proteina della membrana cellulare in qualsiasi quantità, consentendo ai ricercatori di osservare le proteine ai loro livelli naturali nelle membrane native.
Una volta generati i nanodischi, i ricercatori possono utilizzare un numero qualsiasi di tecniche comunemente utilizzate per affinare una particolare proteina di interesse. Quindi quantificano le proteine in ciascun nanodisco con l'aiuto di molecole fluorescenti ad essi attaccate.
Si tratta di un approccio che offre un'elevata risoluzione spaziale senza la necessità di hardware specializzato, ha affermato Bhattacharyya.
"Questo lavoro presenta una nuova tecnica per comprendere come le proteine di membrana, che rappresentano circa il 60% dei bersagli farmacologici, si assemblano in unità funzionali sopra o all'interno del doppio strato lipidico nativo", ha affermato Gerard Walker, co-primo autore dell'articolo e studente laureato. nel laboratorio di Bhattacharyya.
Per dimostrare come potrebbe essere applicato questo metodo, i ricercatori hanno intrapreso un dibattito decennale nel campo della biologia. Una proteina chiamata KRas è mutata in oltre il 90% dei tumori pancreatici umani, suscitando un immenso interesse clinico e terapeutico. Il fatto che le subunità KRas si uniscano per formare dimeri (due unità) o oligomeri (più di due unità) sulle membrane cellulari è rimasto al centro di indagini di lunga data.
Gli studi, tuttavia, hanno prodotto risultati contrastanti. Studi su animali e cellulari, privi di una risoluzione molecolare dettagliata, mostrano prove che le unità KRas si uniscono sulle membrane cellulari. Nel frattempo, le analisi biofisiche, che non mantengono la membrana nativa attorno alle proteine, hanno scoperto che KRas rimane in singole unità, o monomeri.
"Con il nostro metodo, otteniamo il meglio da entrambi i mondi", ha affermato Bhattacharyya. "Manteniamo l'ambiente nativo della membrana e abbiamo una risoluzione spaziale e di singola molecola molto elevata. Quando abbiamo applicato il nostro metodo, abbiamo scoperto che KRas esiste come dimeri e monomeri in quantità simili. Ma quando KRas è mutato, come nei tumori del pancreas, i dimeri aumentano e i monomeri diminuiscono."
La scoperta evidenzia l’importanza della membrana cellulare nativa per comprendere le proteine di membrana e identifica un obiettivo, ovvero la riduzione della dimerizzazione di KRas, per il trattamento del cancro. Questo è solo uno dei tanti modi in cui questo metodo potrebbe essere utilizzato per comprendere il ruolo dell'organizzazione delle proteine di membrana nelle malattie, ha affermato Bhattacharyya.
"È davvero gratificante vedere Native-nanoBleach già applicato con successo a un'ampia varietà di pressanti questioni biologiche nel laboratorio di Bhattacharyya e oltre", ha affermato Caroline Brown, co-autrice dello studio e Ph.D. candidato nel laboratorio del coautore Kallol Gupta, assistente professore di biologia cellulare.
Le proteine di membrana costituiscono un terzo di tutte le proteine del corpo umano e questo approccio può essere utilizzato per studiarle, ha affermato Bhattacharyya.
"È una tecnica generale", ha detto. "Non c'è davvero alcuna limitazione."
Andando avanti, Bhattacharyya e i suoi colleghi sperano di estendere questo approccio allo studio dell'organizzazione delle proteine nelle membrane di vari organelli, strutture, come i mitocondri, contenuti all'interno delle cellule.
Ulteriori informazioni: Gerard Walker et al, Organizzazione oligomerica delle proteine di membrana da membrane native con risoluzione spaziale su scala nanometrica e di singola molecola, Nature Nanotechnology (2023). DOI:10.1038/s41565-023-01547-4
Informazioni sul giornale: Nanotecnologia naturale
Fornito dall'Università di Yale
