Quantificare il campione di RNA misurandone l'assorbanza della luce ultravioletta (UV). Uno spettrofotometro a nano drop utilizzerà solo uno o due microlitri del campione, che è possibile ripristinare. Altri spettrofotometri richiedono un campione molto più grande. Il coefficiente di estinzione per nucleotidi a una lunghezza d'onda UV di 260 nm in un percorso di luce di 1 cm è 20. Sulla base di questo coefficiente di estinzione, l'assorbanza di 40 pg /ml di RNA nelle stesse condizioni è una. Usando queste informazioni, puoi calcolare la concentrazione del tuo campione di RNA.

Fai una diluizione, se necessario, del tuo campione. Una diluizione standard per un microcuvette è 1:40. Effettuare questa diluizione aggiungendo 2 μL di campione di RNA a 78μL di acqua sterile.

Seguire i protocolli del proprio spettrofotometro per calibrare la macchina usando un bianco e quindi determinare la densità ottica del campione a una lunghezza d'onda UV di 260 nm.

Moltiplica l'assorbanza del campione per il fattore di diluizione di 40 μg di RNA /ml. L'equazione sarebbe: "Concentrazione di RNA (μg /ml) = (OD260) x (fattore di diluizione) x (40 μg di RNA /ml) /(1 unità OD260)" (Hofstra.edu) Ad esempio: se il campione è stato diluito 1:40 e la tua lettura di assorbanza era 0.08, moltiplicheresti 0.08 x 40 x 40 = 128 μg /ml = 0.13 μg /μL

Calcola la purezza del campione prendendo un'altra lettura di assorbanza a 280 nm di lunghezza d'onda UV . Il rapporto OD 260 /OD 280 indicherà se - ea quale livello - il campione è contaminato da proteine ​​o fenolo. Un risultato da 1,8 a 2,0 indica RNA di qualità.

Suggerimento

Non dimenticare di calibrare lo spettrofotometro. L'esecuzione di un gel elettroforetico rapido confermerà i risultati delle specifiche.

Avviso

Non presumere che il campione sia puro. Prendendo il tempo per un rapporto OD260 /OD280 consente di risparmiare tempo e denaro lungo la strada.