Il modello genetico di una cellula è codificato nel suo materiale genetico, o DNA. Dato che il DNA non lascia mai il nucleo della cellula, affinché questa informazione entri nel citoplasma dove risiedono altre proteine e componenti biochimici, è necessario prima trascrivere il DNA in RNA messaggero (mRNA o poli (A) RNA). Questo mRNA viene quindi tradotto in proteine che svolgono molte funzioni della cellula. Per rilevare o quantificare mRNA molto rari, creare sonde per microarray o costruire librerie di molecole di DNA complementari, l'mRNA deve essere isolato. Tuttavia, l'estrazione totale di RNA (cioè tutto l'RNA in una cellula) e il successivo isolamento dell'mRNA non sono processi che si escludono a vicenda; il primo deve essere eseguito per estrarre l'mRNA.
Isolamento dell'mRNA dall'RNA totale
Omogeneizzazione TRIzol: l'RNA totale include tutto l'mRNA, l'RNA di trasferimento, l'RNA ribosomale e altri RNA non codificanti . Per separarli da altri componenti cellulari, la cella viene prima aperta per rilasciare il suo contenuto. Questo viene fatto risospendendo le cellule compresse mediante centrifugazione (centrifugando ad alta velocità) in TRIzol Reagent (Life Technologies). Altre versioni di TRIzol (come il reagente TRI di Ambion) funzionano in modo simile.
Isolamento totale dell'RNA: una serie di centrifugazioni viene utilizzata per separare i diversi componenti (proteine, DNA, RNA) della cellula in strati o fasi , all'interno della sospensione. La fase superiore, di colore giallo, è composta da grasso e può essere scartata. La fase desiderata è colorata di rosso, contiene l'RNA totale e viene mantenuta. Dopo l'esecuzione di un'estrazione di fenolo-cloroformio e una serie di lavaggi con alcool mediante isopropanolo ed etanolo, l'RNA può essere rilasciato per l'isolamento dell'mRNA. Aggiungere inibitori di RNasi per impedire a questo enzima di degradare l'RNA totale.
Estrazione di mRNA: è comune utilizzare un kit per isolare gli mRNA, poiché i protocolli di laboratorio casalinghi non generano grandi quantità di mRNA altamente purificati. I kit commerciali includono Invitrogen FastTrack 2.0 o Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Questi passaggi di base sono comuni a tali kit:
a) Miscelare il tampone di lisi inibito da RNasi fornito nel kit con fino a 300 microlitri di RNA totale.
b) Riscaldare per 5 minuti a 65 gradi Celsius e quindi raffreddare immediatamente il campione su ghiaccio per un minuto.
c) Mescolare questo con 0,5 M di cloruro di sodio e quindi sciogliere completamente l'Oligo dT (acido oligodeossialimmidilico) in questo campione.
d) Centrifugare questo campione e recuperare il supernatante, che viene lavato più volte in una serie di tamponi a basso tenore di legame e contenuti nei kit.
e) Eluire l'mRNA diverse volte fino a un volume specificato dal kit (es. 500 microlitri).
f) Precipitare l'eluato con acetato di sodio e precipitazione di etanolo. Risospendere fino a 20 microlitri di acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC).
g) Conservare a -80 gradi Celsius e controllare la qualità e la quantità mediante spettrofotometria.
Suggerimento
Conservare tutti i reagenti, le cellule e l'RNA a freddo immergendoli nel ghiaccio. Ciò impedisce che l'RNA venga degradato da altri enzimi che vengono rilasciati durante il processo di omogeneizzazione.
Avviso
I reagenti come TRIzol sono tossici e non devono essere in contatto con la pelle o le mucose. Osservare sempre i protocolli di laboratorio sicuri quando si maneggia questo reagente.
