Il western blotting è una delle procedure più comuni nei laboratori di biochimica. Fondamentalmente, separa le proteine ​​da un campione per dimensione, quindi esegue test usando anticorpi per determinare se una data proteina è presente. È utile non solo nella ricerca ma anche nei laboratori medici o diagnostici; test per l'HIV e la malattia di Lyme, per esempio, comportano un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), seguito da un Western blot se il test ELISA risulta positivo. Nonostante la sua popolarità, tuttavia, il western blotting ha diversi svantaggi.

Nonquantitative

Le macchine occidentali classiche non sono quantitative. In altre parole, mentre possono dire ai ricercatori se una particolare proteina è presente, non rendono possibile quantificare la quantità di proteina presente. Alcune aziende biotecnologiche vendono kit che consentono ai ricercatori o ai tecnici di laboratorio di quantificare la quantità di proteine ​​presenti utilizzando una curva standard, ma funziona solo se sono disponibili campioni puri della stessa proteina. Inoltre, il peso molecolare di una proteina può essere stimato con il Western blotting, piuttosto che determinato esattamente come con la spettrometria di massa.

Anticorpi

Un Western blot può essere eseguito solo se anticorpi primari contro il le proteine ​​di interesse sono disponibili. Mentre gli anticorpi per molte diverse proteine ​​sono disponibili dalle aziende biotech, non sono economici; se gli anticorpi primari non sono disponibili per una data proteina, non sarà possibile eseguire un Western blot cercando quella particolare proteina. Inoltre, i ricercatori potrebbero voler determinare se una proteina è stata modificata in qualche modo - se è stata fosforilata (aveva un gruppo fosfato collegato ad essa), per esempio - e con la tecnica Western blot hanno bisogno di anticorpi specifici per la modifica protein.

Training

Può essere difficile eseguire un Western blot correttamente e ottenere buoni risultati, quindi lo staff deve essere ben addestrato. In questo come in molto altro, l'esperienza è forse il miglior tutor; anche per un tecnico esperto, tuttavia, una macchia occidentale richiede molto tempo. La porzione di elettroforesi su gel dell'esperimento, ad esempio, richiede in genere da una a due ore per essere eseguita. Altre attività possono essere eseguite mentre il gel è in funzione, naturalmente, ma l'esperimento richiede ancora un po 'di tempo per ottenere risultati.

Altre limitazioni

A volte gli anticorpi possono mostrare legami fuori bersaglio, che può dare risultati più poveri. Inoltre, con il Western blotting, usi un anticorpo contro una specifica proteina, quindi i tuoi risultati ti diranno solo se quella proteina era presente. La spettrometria di massa ad alta risoluzione, al contrario, rivela tutte le proteine ​​presenti in un campione e, diversamente dal classico western blotting, è quantitativa. È importante ricordare, ovviamente, che la spettrometria di massa è molto più costosa e anche tecnicamente più impegnativa da usare rispetto al western blot.