In un nuovo studio, I ricercatori del MIT hanno sviluppato nanoparticelle in grado di fornire il sistema di modifica del genoma CRISPR e modificare specificamente i geni nei topi. Il team ha utilizzato le nanoparticelle per trasportare i componenti CRISPR, eliminando la necessità di utilizzare virus per la consegna.

Utilizzando la nuova tecnica di consegna, i ricercatori sono stati in grado di eliminare alcuni geni in circa l'80% delle cellule epatiche, il miglior tasso di successo mai raggiunto con CRISPR negli animali adulti.

"La cosa davvero eccitante qui è che abbiamo dimostrato che puoi creare una nanoparticella che può essere utilizzata per modificare in modo permanente e specifico il DNA nel fegato di un animale adulto, "dice Daniel Anderson, professore associato presso il Dipartimento di ingegneria chimica del MIT e membro del Koch Institute for Integrative Cancer Research e Institute for Medical Engineering and Science (IMES) del MIT.

Uno dei geni presi di mira in questo studio, noto come Pcsk9, regola i livelli di colesterolo. Le mutazioni nella versione umana del gene sono associate a una malattia rara chiamata ipercolesterolemia familiare dominante, e la FDA ha recentemente approvato due farmaci anticorpali che inibiscono Pcsk9. Però, questi anticorpi devono essere assunti regolarmente, e per il resto della vita del paziente, per fornire una terapia. Le nuove nanoparticelle modificano permanentemente il gene a seguito di un singolo trattamento, e la tecnica offre anche la promessa per il trattamento di altri disturbi del fegato, secondo il team del MIT.

Anderson è l'autore senior dello studio, che appare nel numero del 13 novembre di Biotecnologie naturali . L'autore principale del documento è Hao Yin, ricercatore del Koch Institute. Altri autori includono David H. Koch Institute Professor Robert Langer del MIT, i professori Victor Koteliansky e Timofei Zatsepin dell'Istituto di scienza e tecnologia di Skolkovo, e il professor Wen Xue della University of Massachusetts Medical School.

Mirare alla malattia

Molti scienziati stanno cercando di sviluppare modi sicuri ed efficienti per fornire i componenti necessari per CRISPR, che consiste in un enzima che taglia il DNA chiamato Cas9 e un breve RNA che guida l'enzima in un'area specifica del genoma, dirigere Cas9 dove fare il suo taglio.

Nella maggior parte dei casi, i ricercatori si affidano ai virus per trasportare il gene per Cas9, così come il filamento guida dell'RNA. Nel 2014, Anderson, Yin, e i loro colleghi hanno sviluppato un sistema di somministrazione non virale nella prima dimostrazione in assoluto di curare una malattia (la tirosinemia) con CRISPR in un animale adulto. Però, questo tipo di erogazione richiede un'iniezione ad alta pressione, un metodo che può anche causare qualche danno al fegato.

Dopo, i ricercatori hanno dimostrato di poter fornire i componenti senza l'iniezione ad alta pressione confezionando l'RNA messaggero (mRNA) che codifica Cas9 in una nanoparticella anziché in un virus. Utilizzando questo approccio, in cui l'RNA guida è stato ancora consegnato da un virus, i ricercatori sono stati in grado di modificare il gene bersaglio in circa il 6% degli epatociti, che è sufficiente per trattare la tirosinemia.

Mentre quella tecnica di consegna mantiene la promessa, in alcune situazioni sarebbe meglio avere un sistema di consegna completamente non virale, dice Anderson. Una considerazione è che una volta utilizzato un particolare virus, il paziente svilupperà anticorpi contro di esso, quindi non può essere riutilizzato. Anche, alcuni pazienti hanno anticorpi preesistenti contro i virus testati come veicoli di consegna CRISPR.

Nel nuovo documento Nature Biotechnology, i ricercatori hanno ideato un sistema che fornisce sia Cas9 che la guida dell'RNA utilizzando nanoparticelle, senza bisogno di virus. Per fornire gli RNA guida, hanno dovuto prima modificare chimicamente l'RNA per proteggerlo dagli enzimi nel corpo che normalmente lo scompongono prima che possa raggiungere la sua destinazione.

I ricercatori hanno analizzato la struttura del complesso formato da Cas9 e dalla guida dell'RNA, o sgRNA, per capire quali sezioni del filamento di RNA guida potrebbero essere chimicamente modificate senza interferire con il legame delle due molecole. Sulla base di questa analisi, hanno creato e testato molte possibili combinazioni di modifiche.

"Abbiamo usato la struttura del complesso Cas9 e sgRNA come guida e abbiamo fatto dei test per capire che possiamo modificare fino al 70 percento dell'RNA guida, " Dice Yin. "Potremmo modificarlo pesantemente e non influenzare il legame di sgRNA e Cas9, e questa modifica potenziata migliora davvero l'attività."

Riprogrammare il fegato

I ricercatori hanno confezionato queste guide RNA modificate (che chiamano sgRNA potenziato) in nanoparticelle lipidiche, che avevano precedentemente utilizzato per fornire altri tipi di RNA al fegato, e li ha iniettati nei topi insieme a nanoparticelle contenenti mRNA che codifica per Cas9.

Hanno sperimentato l'eliminazione di alcuni geni diversi espressi dagli epatociti, ma hanno concentrato la maggior parte della loro attenzione sul gene Pcsk9 che regola il colesterolo. I ricercatori sono stati in grado di eliminare questo gene in oltre l'80% delle cellule epatiche, e la proteina Pcsk9 non era rilevabile in questi topi. Hanno anche riscontrato un calo del 35% dei livelli di colesterolo totale dei topi trattati.

I ricercatori stanno ora lavorando per identificare altre malattie del fegato che potrebbero trarre beneficio da questo approccio, e avanzare questi approcci verso l'uso nei pazienti.

"Penso che avere una nanoparticella completamente sintetica in grado di disattivare specificamente i geni potrebbe essere uno strumento potente non solo per Pcsk9 ma anche per altre malattie, " Anderson dice. "Il fegato è un organo davvero importante ed è anche una fonte di malattia per molte persone. Se riesci a riprogrammare il DNA del tuo fegato mentre lo stai ancora usando, pensiamo che ci siano molte malattie che potrebbero essere affrontate".

"Siamo molto entusiasti di vedere questa nuova applicazione della nanotecnologia aprire nuove strade per l'editing genetico, " aggiunge Langer.