proteine della membrana interna (IMPS) :Queste proteine sono incorporate all'interno della membrana interna di E. coli, un doppio strato fosfolipidico che racchiude il citoplasma. Giocano ruoli cruciali in varie funzioni cellulari, tra cui:
* Trasporto: Facilitare il movimento di nutrienti, ioni e prodotti di scarto attraverso la membrana.
* Transduzione del segnale: Trasmettere segnali dall'ambiente all'interno della cella.
* Metabolismo energetico: Partecipare a processi come il trasporto di elettroni e la sintesi di ATP.
proteine della membrana esterna (OMPS) :Queste proteine si trovano nella membrana esterna di E. coli, un secondo doppio strato fosfolipidico che circonda la membrana interna e fornisce supporto e protezione strutturale. Sono coinvolti in:
* Formazione di porin: Creazione di canali che consentono il passaggio di piccole molecole.
* Attività del recettore: Legatura a molecole specifiche e innescando risposte cellulari.
* Adesione: Attaccando a superfici o altre celle.
Ecco un approccio generale per separare questi tipi di proteine da E. coli:
1. Lisi cellulare:
* Lisi meccanica: Usa metodi come la sonicazione o la stampa francese per interrompere la parete cellulare e rilasciare il contenuto della cella.
* Lisi chimica: Utilizzare detergenti come Triton X-100 o SDS per sciogliere i lipidi di membrana.
2. Centrifugazione differenziale:
* Centrifugazione a bassa velocità (10.000 x g): Questo passaggio rimuove i detriti cellulari, tra cui cellule ininterrotte e grandi componenti cellulari.
* Centrifugazione ad alta velocità (100.000 x g): Questo passaggio separa le membrane interne ed esterne dal citoplasma solubile. Viene raccolto il pellet contenente entrambe le membrane.
3. Frazionamento della membrana:
* Centrifugazione del gradiente di saccarosio: Questo metodo separa le membrane in base alla loro densità. La membrana esterna è in genere meno densa della membrana interna, consentendo la loro separazione.
* Triton X-114 Partizionamento di fase: Questa tecnica utilizza un detergente non ionico per separare le proteine in base alla loro idrofobicità. Gli IMP sono più idrofobici degli OMP, portando al loro partizionamento nella fase ricca di detergenti.
4. Purificazione:
* Cromatografia di affinità: Questa tecnica utilizza ligandi specifici che si legano alla proteina bersaglio, consentendo la sua separazione da altre proteine.
* Cromatografia a scambio ionico: Questo metodo separa le proteine in base alla loro carica.
* Cromatografia di esclusione dimensionale: Questa tecnica separa le proteine in base alle loro dimensioni.
5. Conferma:
* SDS-PAGE: Questa tecnica di elettroforesi separa le proteine in base al loro peso molecolare.
* Western blotting: Questa tecnica utilizza anticorpi per rilevare proteine specifiche.
Note importanti:
* Il protocollo specifico dipenderà dalla proteina target e dalle sue proprietà.
* L'ottimizzazione di ogni fase è cruciale per ottenere proteine pura e funzionale.
* Le tecniche come la spettrometria di massa possono essere utilizzate per ulteriori analisi delle frazioni proteiche separate.
Kit commerciali:
Sono disponibili diversi kit commerciali per l'isolamento di proteine di membrana interne ed esterne di E. coli, che possono semplificare il processo.
Seguendo questi passaggi e scegliendo le tecniche appropriate, i ricercatori possono separare e purificare con successo le proteine della membrana interna ed esterna di E. coli, consentendo ulteriori analisi della loro struttura, funzione e interazioni.
