1. Interruzione cellulare:
* Metodi meccanici:
* Omogeneizzazione: Usando un frullatore o un omogeneizzatore ad alta velocità per rompere fisicamente le cellule aperte.
* Sonication: Usando onde sonore per interrompere le membrane cellulari.
* Pressa francese: Forzando le celle attraverso una piccola apertura ad alta pressione.
* macinatura: Usando un mortaio e un pestello per rompere fisicamente le cellule.
* Metodi chimici:
* Detersivi: Interrompere le membrane cellulari dissolvendo i lipidi.
* enzimi: Usa enzimi specifici come il lisozima per degradare le pareti cellulari.
* Shock osmotico: Modifica della pressione osmotica della soluzione per interrompere le membrane cellulari.
2. Centrifugazione differenziale:
* Dopo l'interruzione delle cellule, il lisato cellulare viene fatto girare a velocità e durate crescenti. Ciò separa i componenti in base alle loro dimensioni e densità.
* Centrifugazione a bassa velocità: Pellet componenti più grandi come nuclei e detriti cellulari.
* Centrifugazione a media velocità: Mitocondri e lisosomi a pellet.
* Centrifugazione ad alta velocità: Microsomi a pellet e ribosomi.
* Ultracentrifugation: Pellet componenti più piccoli come proteine e acidi nucleici.
3. Centrifugazione del gradiente di densità:
* Questo metodo perfeziona ulteriormente la separazione ottenuta mediante centrifugazione differenziale. Un gradiente di saccarosio o altre sostanze viene creato in un tubo e il lisato cellulare viene stratificato in cima. Durante la centrifugazione, i componenti si muovono attraverso il gradiente fino a raggiungere una densità pari alla propria.
* Tipi:
* Gradiente di saccarosio: Comunemente usato per separare gli organelli.
* Gradiente di cloruro di cesio: Eccellente per isolare il DNA e l'RNA.
4. Cromatografia di affinità:
* Questo metodo sfrutta il legame specifico di una molecola target a un ligando immobilizzato su una colonna.
* Ligando: Una molecola che si lega specificamente alla molecola target.
* colonna: Una matrice solida con il ligando immobilizzato.
* eluizione: Dopo il legame, la molecola target viene eluita dalla colonna usando una soluzione specifica.
5. Elettroforesi:
* Utilizzato per separare le proteine in base a dimensioni e carica e acidi nucleici in base alle dimensioni.
* SDS-PAGE: Separa le proteine in base alle dimensioni.
* Elettroforesi in gel di agarosio: Separa gli acidi nucleici in base alle dimensioni.
6. Immunoprecipitazione:
* Questo metodo utilizza anticorpi per isolare proteine specifiche.
* Anticorpi: Legarsi a una specifica proteina di interesse.
* PRECCITAZIONE: Dopo il legame, il complesso proteina-anticorpo viene precipitato fuori dalla soluzione.
7. Citometria a flusso:
* Questo metodo utilizza laser e sonde fluorescenti per analizzare e ordinare cellule o componenti cellulari in base alle loro caratteristiche fisiche e biologiche.
Esempio:isolamento mitocondri
* Le cellule vengono interrotte usando omogeneizzazione o una stampa francese.
* Il lisato cellulare è centrifugato a una velocità media per i mitocondri a pellet.
* Il pellet è risospeso e ulteriormente purificato usando la centrifugazione del gradiente di densità.
La scelta del metodo dipende dal tipo di cellula specifico, dall'organello o dalla molecola di interesse e dal livello desiderato di purezza. Ogni tecnica ha i suoi punti di forza e di debolezza e i ricercatori spesso usano una combinazione di metodi per ottenere i risultati desiderati.
