Di John Brennan
Aggiornato il 24 marzo 2022
L'elettroforesi su gel rimane il cavallo di battaglia dei laboratori di biologia molecolare. Applicando un campo elettrico, il DNA e le proteine vengono separati, solitamente in base alle dimensioni, all'interno di una matrice di gel. Sebbene la tecnica sia comune, il modo in cui i risultati vengono interpretati varia a seconda dell'applicazione a valle, che si tratti di Western blot, Northern blot, Southern blot o semplice analisi dell'agarosio.
Quando lavori con i gel di agarosio, due compiti dominano:1) distinguere i plasmidi non tagliati, intaccati e lineari dall'inserto e 2) stimare le dimensioni dei frammenti utilizzando una curva standard affidabile. I seguenti passaggi ti guidano attraverso questo processo in modo chiaro e riproducibile.
Consultare il quaderno di laboratorio per verificare quale campione è stato caricato in ciascuna corsia. Le etichette delle corsie registrate al momento del caricamento sono il punto di partenza per tutti i calcoli successivi.
La scala contiene frammenti di lunghezza nota. Le sue distanze di migrazione serviranno come riferimento per dimensionare le bande sconosciute.
Usando un righello, misura la distanza dal pozzo al colorante tracciante (il colorante che viaggia più lontano). Registra questo valore; le unità sono arbitrarie finché sono coerenti.
Misurare la distanza di ciascuna fascia della scala dal pozzo, quindi dividerla per la distanza del colorante di tracciamento. Ciò produce la mobilità relativa (fattore di mobilità) per ciascuno standard.
Esempio:se il colorante di tracciamento ha percorso 6 pollici e le fasce a scala hanno percorso 5, 4,5 e 3,5 pollici, le mobilità relative sono 0,833, 0,75 e 0,583.
Inserisci le mobilità relative e le dimensioni dei frammenti corrispondenti (in kilobasi) in un foglio di calcolo. Solitamente i produttori forniscono queste dimensioni nella scheda tecnica della scala.
Crea un grafico con mobilità relativa sull'asse X e dimensione del frammento sull'asse Y.
Utilizza la funzione Trendline per adattare un'equazione della legge di potenza (ad esempio, y =ax^‑2). Puntare a un R² di almeno 0,90 per garantire una curva affidabile.
I frammenti più piccoli migrano più lontano. Si noti che i plasmidi superavvolti (non tagliati) viaggiano più lontano dei frammenti lineari della stessa dimensione, mentre i plasmidi intaccati migrano più lentamente.
Fai un riferimento incrociato alle bande di ciascuna corsia con il campione che hai caricato. Per un plasmide digerito con due enzimi, dovresti vedere due bande distinte:una vicino alla parte superiore (inserto) e una vicino al fondo (plasmide tagliato). Un digest a singolo enzima dovrebbe produrre una singola banda che viaggia leggermente più lontano del plasmide non tagliato ma molto meno dell'inserto.
Misurare la distanza dal pozzo a ciascuna banda sconosciuta, dividerla per la distanza del colorante di tracciamento e ottenere la mobilità relativa.
Inserisci le mobilità relative nell'equazione derivata nel passaggio 7 per calcolare la dimensione approssimativa di ciascun frammento.
Se osservi bande ampie e luminose vicino al fondo di ogni corsia, probabilmente hai una contaminazione di RNA:rivedi i passaggi di purificazione.
