Illustrazione del metodo "homo-FRET" della Rice University per l'osservazione delle reazioni di fosforilazione in tempo reale in sistemi sensoriali bicomponenti in batteri vivi. Stimoli specifici all'esterno della cellula (in alto) avviano la fosforilazione (al centro), che attivano le proteine regolatrici della risposta che formano coppie (in basso a destra) per produrre una cascata biochimica che alla fine cambia il comportamento della cellula. Per osservare la fosforilazione in tempo reale, i ricercatori della Rice hanno progettato ceppi di E. coli per produrre tag fluorescenti verdi che depolarizzano la luce di un laser di eccitazione solo quando interagiscono in coppia (in basso a destra). Credito:Ryan Butcher/Rice University
I biologi sintetici della Rice University hanno sviluppato la prima tecnologia per osservare l'attività in tempo reale di alcuni dei circuiti di elaborazione del segnale più comuni nei batteri, compresi i patogeni mortali che utilizzano i circuiti per aumentare la loro virulenza e per sviluppare la resistenza ai farmaci antibiotici.
I sistemi a due componenti sono circuiti sensoriali utilizzati dai batteri per reagire all'ambiente circostante e sopravvivere. I batteri utilizzano i circuiti, noti anche come percorsi di trasduzione del segnale, per rilevare una "gamma impareggiabile di stimoli" dalla luce e dagli ioni metallici al pH e persino i messaggi dei loro amici e vicini, ha affermato il professore di bioingegneria della Rice Jeffrey Tabor.
Il nuovo strumento ottico di Tabor e del ricercatore post-dottorato Ryan Butcher per l'osservazione delle reazioni di fosforilazione in tempo reale in sistemi a due componenti è descritto in uno studio pubblicato questa settimana negli Proceedings of the National Academy of Sciences .
"I batteri utilizzano sistemi a due componenti per attivare la virulenza e la resistenza agli antibiotici, colonizzare ospiti umani e vegetali, formare biofilm e dispositivi medici nocivi", ha affermato Tabor, professore di bioingegneria e bioscienze.
Il laboratorio di Tabor da anni studia sistemi bicomponenti. Nel 2019, il suo team ha presentato un toolkit di biohacking che i biologi sintetici potrebbero utilizzare per mescolare e abbinare decine di migliaia di input sensoriali e output genetici dai circuiti.
Uno degli usi più importanti di quel toolkit è stato svelare il duplice mistero dei sistemi a due componenti. Come suggerisce il nome, i circuiti hanno due funzioni:rilevare uno stimolo all'esterno della cellula e modificare il comportamento della cellula in risposta a quello stimolo.
Il primo componente, noto come chinasi sensore, sporge tipicamente attraverso la parete esterna della cellula e può essere attivato solo da uno specifico segnale chimico. Una volta attivato, innesca una cascata biochimica, una reazione a catena all'interno della cellula che termina con la cellula che cambia il suo comportamento in risposta agli stimoli.
Il primo passo nella cascata è un processo chiamato fosforilazione, che alla fine si traduce nell'attivazione del secondo componente del sistema, il regolatore di risposta.
Sebbene le reazioni di fosforilazione siano fondamentali nelle decine di migliaia di sistemi bicomponenti impiegati nei batteri, è stato molto difficile osservarle direttamente nei batteri vivi. Ciò è in parte dovuto al fatto che i regolatori della risposta devono in genere unirsi per formare coppie per portare avanti la cascata biologica che porta alla risposta allo stimolo.
"L'analisi sperimentale della fosforilazione richiede spesso la purificazione delle proteine dai batteri e l'analisi utilizzando metodi in vitro laboriosi come l'elettroforesi su gel", ha affermato Butcher.
Butcher ha creato un metodo molto più semplice che utilizza tag proteici fluorescenti e luce fluorescente polarizzata. Ha progettato ceppi di E. coli per produrre sonde proteiche fluorescenti mNeonGreen che depolarizzano la luce da un laser di eccitazione, ma solo se interagiscono come coppie. In una serie di test, Butcher e Tabor hanno dimostrato che il loro metodo potrebbe essere utilizzato per monitorare l'entità e la velocità dell'attivazione del regolatore di risposta in una varietà di condizioni ambientali.
Il metodo è chiamato "trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza omotipica" o omo-FRET in breve. Tabor ha affermato che i ricercatori possono usarlo per seguire l'attivazione di sistemi a due componenti con una risoluzione temporale molto più elevata rispetto a quanto possibile in precedenza.
Nello studio, lui e Butcher hanno dimostrato l'utilità dell'omo-FRET osservando un sistema bicomponente attivato dai nitrati che è noto per svolgere un ruolo nella colonizzazione gastrointestinale da parte di E. coli, Salmonella e altri agenti patogeni.
"I microbiologi sanno da tempo che questo circuito genetico è utilizzato da una serie di agenti patogeni, ma ancora non capiamo appieno come funzioni", ha affermato Tabor.
Usando il loro metodo, Tabor e Butcher hanno scoperto un impulso di attività precedentemente non riportato nel circuito in risposta all'aggiunta di nitrato. L'impulso sembra nascere a causa della rapida attivazione del sistema bicomponente, seguita dal consumo di nitrato da parte dei batteri e dalla corrispondente disattivazione.
"Questa è una finestra su come funziona questo circuito, ed è il tipo di cosa che sarebbe stato molto più difficile da definire usando i metodi precedenti", ha detto Tabor. "Con homo-FRET possiamo osservare il circuito rispondere al cambiamento dei livelli di nitrati mentre sta accadendo."
"Pensiamo che l'homo-FRET possa essere utilizzato per progettare biosensori che rispondono 10 volte più velocemente delle alternative attuali e che noi e altri saremo in grado di usarlo per fare nuove scoperte in una serie di altri percorsi batterici", ha affermato. + Esplora ulteriormente
