Con una nuova tecnica per creare uno spettro di coloranti luminosi, i chimici non inseguono più arcobaleni.

Lo scambio di specifici elementi costitutivi chimici in molecole fluorescenti chiamate rodamine può generare quasi tutti i desideri degli scienziati del colore:ROYGBIV e oltre, i ricercatori riferiscono il 4 settembre 2017 sulla rivista Metodi della natura .

Il lavoro offre agli scienziati un modo per regolare deliberatamente le proprietà dei coloranti esistenti, rendendoli più audaci, più luminoso, e anche più permeabile alle cellule. Una tavolozza così estesa di coloranti potrebbe aiutare i ricercatori a illuminare meglio il funzionamento interno delle cellule, afferma il leader dello studio Luke Lavis, un leader del gruppo presso il Janelia Research Campus dell'Howard Hughes Medical Institute ad Ashburn, Virginia. La sua squadra ha illuminato i nuclei delle cellule, ha fatto brillare i cervelli dei moscerini della frutta, e ha evidenziato i neuroni della corteccia visiva nei topi che avevano minuscole finestre di vetro inserite nei loro crani.

Gli scienziati erano soliti inventare diversi coloranti principalmente per tentativi ed errori, dice Lavis. "Ora, abbiamo capito le regole, e possiamo fare quasi tutti i colori." Il metodo del suo team potrebbe consentire ai chimici di sintetizzare centinaia di colori diversi.

Una storia brillante

Fino a circa 20 anni fa, gli scienziati si sono affidati a coloranti chimici fluorescenti per rendere visibili le molecole biologiche. Per sbirciare all'interno delle cellule, organelli coloranti, e altri esperimenti di imaging, "la chimica era re, "Lavis ha scritto in un 13 luglio, Prospettiva 2017 sulla rivista Biochimica . Poi, il re è stato cacciato dal trono da una proteina di medusa verde brillante chiamata GFP.

Nel 1994, scienziati hanno segnalato l'uso di un trucco genetico per contrastare la GFP, la proteina fluorescente verde, su altre proteine ​​cellulari; è come costringere le proteine ​​a tenere un bastoncino luminoso. Questo trucco ha fornito ai ricercatori un modo più semplice per tracciare i movimenti delle proteine ​​al microscopio, senza utilizzare costosi coloranti sintetici. L'innovazione si è diffusa nel campo dell'imaging biologico. Nel 2007, la miscelazione degli scienziati di GFP e altre due proteine ​​fluorescenti ha permesso loro di dipingere i neuroni di topo una sfilata di colori vividi in una tecnica nota come "Brainbow". Un anno dopo, la scoperta e lo sviluppo della GFP hanno valso il Premio Nobel per la chimica a tre scienziati, compreso il compianto Roger Tsien, un investigatore HHMI.

Ma GFP ha anche dei lati oscuri. È una molecola relativamente goffa costituita da un insieme limitato di amminoacidi naturali. Quindi la GFP non è sempre abbastanza brillante da rivelare ciò che gli scienziati stanno cercando di vedere.

Così i ricercatori sono tornati alla chimica. Gli scienziati avevano sviluppato microscopi all'avanguardia e nuove tecniche per etichettare i contenuti cellulari, Lavis dice, ma i coloranti per marcare le molecole all'interno delle cellule erano ancora bloccati nel diciannovesimo secolo. Il suo team si è concentrato sulle rodamine, perché sono particolarmente luminosi e permeabili alle cellule, quindi scivolano facilmente nelle cellule e le fanno brillare. Ma nonostante lavori con le rodamine da più di 100 anni, i chimici avevano creato solo poche dozzine di colori, e la maggior parte erano sfumature simili che andavano dal verde all'arancione.

Fino a poco tempo fa, fare nuove rodamine non è stato facile. Gli scienziati usavano ancora tecniche fin dai primi giorni della chimica, ingredienti chimici bollenti in acido solforico. Questo costringe le molecole a legarsi insieme in quella che viene chiamata reazione di condensazione. La miscelazione di diversi elementi costitutivi può produrre coloranti nuovi e insoliti. Ma gli ingredienti dovevano essere abbastanza duri da sopravvivere al bagno acido bollente, che non lasciava molte opzioni.

Fallo brillare

Nel 2011, Il team di Lavis ha sviluppato un nuovo modo di armeggiare con la struttura delle rodamine, in condizioni più miti. Usando una reazione innescata dal metallo palladio, i ricercatori hanno potuto saltare la fase dell'acido e costruire coloranti con blocchi di costruzione più complicati di quelli usati in precedenza.

questo più gentile, un approccio più gentile ha aperto le porte a un vasto nuovo mondo di coloranti, e la squadra di Lavis si è tuffata. Quattro anni dopo, hanno rivelato i coloranti Janelia Fluor, molecole fluorescenti fino a 50 volte più luminose di altri coloranti, e anche più stabile. Il segreto dietro i coloranti Janelia Fluor è una minuscola appendice di forma quadrata chiamata anello di azetidina, una struttura resa possibile solo dal nuovo approccio chimico di Lavis.

Gli scienziati possono utilizzare una varietà di strategie per ottenere le molecole di colorante brillante sulla proteina che vogliono studiare. Quindi, possono concentrarsi sulla proteina illuminata, e guardalo muoversi e interagire con altre molecole, senza la solita confusione di fondo.

"Per noi, è stata una rivoluzione totale nel campo dell'imaging a singola molecola, " afferma il biologo molecolare Xavier Darzacq dell'Università della California, Berkeley. Prima di utilizzare i coloranti Janelia Fluor, le proteine ​​del fattore di trascrizione marcate con fluorescenza che il suo team ha studiato erano troppo deboli per essere catturate in immagini nitide. I ricercatori hanno dovuto tenere aperto l'otturatore della fotocamera per 10 millisecondi per raccogliere abbastanza luce. È abbastanza a lungo da far vagare le proteine, quindi l'immagine risulterebbe sfocata, come la fotografia di un bambino contorto. Ma i coloranti Janelia sono abbastanza brillanti da consentire al suo team di catturare le molecole in azione in appena un millisecondo, dice Darzacq. Scatti così rapidi hanno permesso al suo team di fare esperimenti di laboratorio che descrive come "semplicemente impensabili fino a pochi anni fa".

Ora, Il gruppo di Lavis ha scoperto come mettere a punto i propri coloranti fluorescenti, modificando ulteriormente la struttura delle rodamine. Le rodamine hanno un design di base a quattro anelli con gruppi di atomi che sporgono da diverse parti degli anelli. Nei lavori precedenti, gli scienziati hanno sviluppato strategie per la messa a punto grossolana dei coloranti:ritaglia un'intera appendice qui, e puoi fare una tintura verde. Inserisci un atomo di silicio lì, e tu hai rosso. Lavis scoprì che posizionando con cura solo pochi nuovi atomi nella struttura del colorante, anche il colore e le proprietà chimiche dei coloranti potrebbero essere perfezionati, permettendo molte sfumature di verde da un'unica impalcatura. È come passare dalla classica confezione da otto pastelli alla scatola jumbo da 64.

In un documento separato, pubblicato il 9 agosto 2017 sulla rivista ACS Central Science , il team ha descritto un modo per modificare l'anello inferiore della struttura del colorante.

"La cosa fondamentale è che è tutto modulare e razionale, " dice Lavis. Scegli gli atomi giusti, lui spiega, e i chimici possono progettare coloranti con quasi tutte le proprietà che desiderano.

Il suo gruppo ha innestato diverse sostanze chimiche su rodamina, e poi ha analizzato le proprietà dei nuovi coloranti. "Nessuno aveva mai considerato le rodamine in questo modo sistematico prima d'ora, ", afferma il coautore principale Jonathan Grimm, uno scienziato senior presso Janelia.

I coloranti sono sintetizzati in un unico passaggio con ingredienti poco costosi, dice Lavis. Ciò rende i coloranti più economici delle alternative commerciali:pochi centesimi per fiala. Il basso costo ha permesso al suo team di condividere il proprio lavoro con scienziati di tutto il mondo. Lavis, Grimm, e colleghi hanno ora spedito migliaia di fiale a centinaia di laboratori diversi.

"Questi coloranti sono un completo punto di svolta, "dice Ethan Garner, un biologo di cellule batteriche dell'Università di Harvard che le ha utilizzate per tracciare il percorso di singole molecole nel suo laboratorio. L'unico aspetto negativo era che gli scienziati non avevano molti colori diversi tra cui scegliere. Ma ora, lui dice, con il lavoro di Lavis, "Possono effettivamente coprire l'intera gamma spettrale".