I dispositivi di coltura cellulare Liver-on-a-chip sono modelli biomimetici attraenti nella scoperta di farmaci, ricerca in tossicologia e ingegneria dei tessuti. Per mantenere specifiche funzioni delle cellule epatiche su un chip in laboratorio, devono essere soddisfatti tipi di cellule e condizioni di coltura adeguati, che include l'orientamento cellulare 3D e un apporto costante di nutrienti e ossigeno. Rispetto alle tradizionali tecniche di coltura cellulare 2D, i dispositivi organ-on-a-chip offrono versatilità e biomimetica efficace adatta per applicazioni avanzate nella scoperta di farmaci e in medicina.

In un recente studio ora pubblicato su Biofabbricazione , Jonas Christoffersson e colleghi hanno dimostrato come gli idrogel che imitano la matrice extracellulare possono supportare la funzionalità e la vitalità degli epatociti in un dispositivo perfuso di fegato su chip. I ricercatori interdisciplinari della divisione di biotecnologia e fisica molecolare hanno progettato un sistema di idrogel basato su ialuronano e polimeri di polietilenglicole (HA-PEG). Hanno sviluppato gli idrogel utilizzando la chimica dei clic. Per abilitare il processo, gli scienziati hanno condotto una reazione biortogonale (chimica che si verifica all'interno dei sistemi viventi senza l'interferenza delle reazioni biochimiche native) tra una frazione di cicloottino e un partner di reazione marcato con alchino azide, nota come cicloaddizione di alchino azide ceppo-promossa (SPAAC).

I nuovi materiali idrogel sono stati ingegnerizzati e caratterizzati rispetto agli idrogel di agarosio e alginato esistenti per la compatibilità cellulare (citocompatibilità). Per gli studi di biofunzionalizzazione, i ricercatori hanno utilizzato epatociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti umane indotte (hiPS-HEP). Per migliorare la citocompatibilità superficiale del biomateriale, Gli idrogel HA-PEG sono stati alterati con motivi di adesione cellulare modificati con azide per facilitare un efficace collegamento del materiale cellulare. Nel biomateriale funzionalizzato in superficie, le cellule staminali degli epatociti sono migrate e sono cresciute con orientamenti 3D, con maggiore vitalità. Gli scienziati hanno osservato una maggiore produzione di albumina sul nuovo materiale (caratteristica proteina epatica), rispetto alle cellule coltivate su altri idrogel. Il flessibile, Il sistema di idrogel reticolato SPAAC con coltura cellulare 3D perfusa di hiPS-HEP è un materiale promettente per ottimizzare i dispositivi fegato su chip.

Bioreattori miniaturizzati noti come "organ-on-chips", sono recentemente emersi come modelli di coltura cellulare alternativi che imitano meglio il microambiente biologico in vivo in laboratorio. Il fegato è un modello di particolare interesse nella ricerca medica a causa dell'epatotossicità dei farmaci osservata in tutte le fasi dello sviluppo clinico dei farmaci. Pubblicazioni precedenti descrivono in dettaglio l'uso di organ-on-chip per prevedere l'esito dell'impatto di un farmaco negli studi clinici e valutare le interazioni farmacologiche con gli epatociti in laboratorio.

A causa della loro più ampia adozione in contesti accademici e industriali, i bioreattori richiedono materiali e condizioni ottimizzati per la fabbricazione ad alto rendimento. Le condizioni includono la sostituzione del comune materiale di prototipazione polidimetilsilossano (PDMS), integrando cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) su un biomateriale morbido che ne facilita la crescita e riduce al minimo il grande volume morto causato dai serbatoi microfluidici e dai tubi dei dispositivi organo su chip.

Il nuovo biomateriale preparato nello studio conteneva due costituenti principali reticolati tramite SPAAC; un acido ialuronico modificato con cicloocita (HA-BCN) e un PEG modificato con azide multiarmato [p(N ₃ ) ₈ ]. Il BCN ha reagito con azidi (N ₃ ) sul polimero PEG a 8 bracci con terminazione N ₃ -frazioni per formare un 1 stabile, 2, 3-triazolo. Christoffersson et al. reazioni chimiche completate in condizioni fisiologiche per formare gli idrogel con proprietà viscoelastiche regolabili. La strategia di reticolazione era ideale per fabbricare idrogel per la coltura cellulare 3D; poiché le cellule potevano essere incapsulate nel biomateriale senza compromettere la loro vitalità ed erano adatte per l'uso in dispositivi microfluidici. Gli scienziati hanno utilizzato porzioni SPAAC in eccesso sul nuovo biomateriale per attaccare diversi ligandi, compresi i peptidi RGD, per promuovere le interazioni all'interfaccia cellula-materiale.

Successivamente, gli scienziati hanno variato la composizione dei due costituenti principali per comprendere le proprietà viscoelastiche risultanti, come il modulo di stoccaggio (G') e il modulo di perdita (G") degli idrogel tramite reologia oscillatoria (tecnica per misurare il comportamento viscoelastico di materiali morbidi). Hanno controllato la cinetica di gelificazione del nuovo idrogel a temperature crescenti. Cinetica di gelificazione di il nuovo biomateriale era abbastanza lento per la distribuzione omogenea delle cellule ma abbastanza rapido per prevenire la sedimentazione cellulare.La capacità di controllare la cinetica di gelificazione ha permesso agli scienziati di prendere in considerazione una varietà di strategie di biofabbricazione (ad es. applicazioni di chip.

Christoffersson et al. successivamente ha confrontato gli idrogel HA-PEG con gli scaffold di coltura cellulare 3D ben consolidati:agarosio e idrogel di alginato. Al fine di determinare le proprietà viscoelastiche finali adatte per esperimenti di coltura cellulare 3D, hanno usato la reologia oscillatoria per esaminare le diverse concentrazioni di polimeri. Gli scienziati hanno analizzato la composizione dei materiali finalizzati utilizzando immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM).

Il design e la configurazione del fegato su un chip dovevano soddisfare due criteri chiave nello studio:

1. Consentire la perfusione (passaggio di fluido) del mezzo di coltura cellulare attraverso la superficie dell'idrogel per uno scambio costante di mezzi nutritivi, da e verso gli epatociti incapsulati.

2. Consentire il campionamento dei mezzi perfusi per l'analisi sperimentale durante la coltura cellulare in corso, senza intaccare gli epatociti e l'idrogel.

Per soddisfare questi criteri, gli scienziati hanno utilizzato un dispositivo di coltura cellulare 3D commerciale (μ-Slide III 3D Perfusion IbiTreat) contenente due camere consecutive (2 x 30 μL) in tre array paralleli, ciascuno collegato a serbatoi di supporto per perfondere il liquido. Per un'efficace perfusione, hanno montato il dispositivo su un tavolo oscillante automatico invertendo la direzione del perfusato attraverso le camere contenenti idrogel. Il setup sperimentale ha permesso la perfusione attraverso il dispositivo, soddisfacendo i primi criteri. Per soddisfare il secondo criterio, le pareti localizzate adiacenti alle camere dell'idrogel hanno permesso agli scienziati di campionare il perfusato senza interferire con l'idrogel o i costituenti cellulari.

Gli scienziati hanno prima studiato la biofunzionalizzazione dei dispositivi liver-on-a-chip nello studio con cellule HEPG2 (linea cellulare di carcinoma epatico) incapsulate in idrogel, dopo 3, 7 e 9 giorni di coltura cellulare. Hanno confrontato la morfologia cellulare, vitalità e funzionalità con agarosio e idrogel di alginato. Lo studio ha incluso saggi vivi/morti per confermare la vitalità cellulare e ha ulteriormente confermato la funzionalità di HepG2 rilevando le secrezioni di albumina e urea nel surnatante della coltura cellulare.

Per una migliore funzionalità cellulare (attaccamento alla superficie e mobilità sui materiali), gli scienziati hanno innestato motivi di adesione cellulare come peptidi RGD lineari o ciclici (linRGD lineare o cRGD ciclico) sugli idrogel. In questo caso, Le cellule hiPS-HEP (cellule staminali degli epatociti) sono state coltivate in diverse composizioni di idrogel per 13 giorni per esaminare la morfologia e la vitalità (colorazione viva/morta) dopo le interazioni cellula-materiale. Gli scienziati hanno utilizzato sei diverse superfici di biomateriali a base di idrogel negli esperimenti, tra cui; 2D (mantello HEP), Agarosio, alginato, HA-PEG, HA-PEG (linRGD) e HA-PEG (cRGD).

Le cellule hiPS-HEP incapsulate e coltivate nell'idrogel modificato sono cresciute all'interno di costrutti 2D e 3D veri. Per testare la funzionalità delle cellule hiPS-HEP coltivate (cellule staminali), gli scienziati hanno quantificato la loro escrezione di albumina e urea. I risultati hanno mostrato che solo i surnatanti delle cellule staminali coltivate in superfici 2D e in presenza degli idrogel del motivo cRGD secernono albumina.

In base ai risultati, gli scienziati hanno attribuito la maggiore quantità di albumina sul rivestimento HEP 2D alla velocità di diffusione dell'albumina all'interno degli idrogel; il trasferimento attraverso il rivestimento 2D è più veloce del 3D. La maggiore concentrazione di albumina con idrogel legati al motivo cRGD, correlato con l'aumento della crescita cellulare e della vitalità osservata sulle superfici del biomateriale legato al cRGD. Di conseguenza, gli scienziati intendono utilizzare forme cicliche del peptide RGD per assistere in futuro la coltura di cellule staminali di epatociti su idrogel preparati per dispositivi fegato-on-a-chip.

In questo modo, lo studio ha dettagliato i vantaggi dell'utilizzo di idrogel a base di ialuronano-PEG modificato con peptidi RGD per colture 3D di epatociti (circa 13 giorni) in una configurazione fegato su chip. Come parametri di riferimento dello studio, Christofferfsson e collaboratori hanno utilizzato gli idrogel di alginato e agarosio comunemente disponibili. Nel futuro, gli scienziati ottimizzeranno le proprietà viscoelastiche e la concentrazione dei motivi di adesione cellulare sul sistema idrogel HA-PEG per la citocompatibilità biomimetica. Il sistema idrogel ottimizzato può essere combinato con la configurazione del dispositivo per facilitare piattaforme fegato su chip fisiologicamente rilevanti per la ricerca clinica in tossicologia dei farmaci, drug discovery and regenerative medicine.

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