Un team di Città del Capo ha recentemente pubblicato la prima carta per microscopia crioelettronica (EM) ad alta risoluzione proveniente dall'Africa. Come descritto in Biologia della comunicazione della natura , il team ha risolto la struttura di un enzima nitrilasi con una risoluzione prossima a quella atomica e ha utilizzato le intuizioni strutturali per progettare un enzima mutante che potrebbe essere messo a punto per applicazioni in biotecnologia. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso un programma di accesso finanziato dal progetto Synchrotron Techniques for African Research and Technology, una sovvenzione collaborativa che cerca di costruire partenariati tra scienziati leader a livello mondiale in Africa e nel Regno Unito che lavorano insieme sulla ricerca che utilizza la scienza del sincrotrone.

Le nitrilasi sono un'affascinante classe di enzimi vegetali che svolgono un ruolo significativo nella sintesi di un'ampia gamma di importanti sostanze chimiche. Questi enzimi hanno tipicamente specificità per una piccola gamma di substrati, tuttavia hanno un enorme potenziale biotecnologico. Un team di scienziati dell'Università di Città del Capo si è proposto di realizzare questo potenziale studiando la struttura degli enzimi utilizzando la crio-EM presso l'Electron Bio-imaging Center (eBIC).

Dopo essere riuscito con successo a ottenere informazioni strutturali di alta qualità, il team ha ottenuto un'immagine con risoluzione prossima a quella atomica (3,4 ) di una nitrilasi derivata dalla famiglia dei cavoli. Utilizzando questa struttura, il team ha progettato in modo semi-razionale una nuova nitrilasi mutante che agiva su substrati non catalizzati da altre nitrilasi naturali.

Il team spera di poter progredire nella produzione di nitrilasi "designer" per qualsiasi substrato necessario all'industria, che si tratti di prodotti farmaceutici, prodotti chimici fini o anche cibo. Sono previsti ulteriori lavori presso l'eBIC per continuare questo fruttuoso studio.

Torsioni elicoidali

Le nitrilasi sono una classe di enzimi utilizzati per produrre acidi carbossilici, ammoniaca e ammidi per la sintesi su larga scala di medicinali e sostanze chimiche di importanza industriale. Un team di scienziati dell'Università di Città del Capo è rimasto affascinato da questi enzimi e ha voluto studiare come si sono evoluti e correlare la loro struttura e funzione.

Il gruppo inizialmente ha confrontato due diverse nitrilasi da Arabidopsis thaliana (un membro della famiglia dei cavoli) e ho visto che uno aveva una vasta gamma di substrati, ma l'altro era molto più specifico per un piccolo numero di substrati. Hanno effettuato una serie di mutazioni nella tasca di legame degli enzimi e hanno scoperto che la commutazione di un singolo amminoacido modificava la preferenza del substrato delle nitrilasi. Con questa conoscenza allettante, il gruppo ha deciso di ottenere informazioni strutturali dettagliate per rivelare come le nitrilasi selezionano i loro substrati.

Dottor Jeremy Woodward, Docente di Biochimica Medica presso l'Università di Cape Town e Principal Investigator dello studio ha spiegato le motivazioni del suo gruppo,

"Per cercare di capire cosa stava succedendo, abbiamo ripreso tutti gli enzimi utilizzando la crio-EM a bassa risoluzione presso l'Università di Città del Capo e abbiamo scoperto che formavano filamenti, e che la tenuta della loro torsione elicoidale era correlata alla dimensione del substrato. Infatti, l'amminoacido che abbiamo scoperto si trovava in corrispondenza di un'interfaccia tra due subunità elicoidali. Abbiamo osservato questa correlazione con un gran numero di enzimi nitrilasi, ma non siamo riusciti a spiegare cosa stava succedendo a livello molecolare fino alla nostra recente visita a eBIC a Diamond Light Source."

Struttura quasi atomica

Il team aveva precedentemente utilizzato la microscopia elettronica a colorazione negativa (EM) che è limitata a una risoluzione di 20 Å, e non è abbastanza alto per vedere i dettagli atomici nella struttura. Inoltre, lavori precedenti di altri laboratori avevano dimostrato che le nitrilasi non possono essere cristallizzate, quindi la crio-EM era la loro unica opzione.

"Questo era l'unico metodo che poteva essere usato per rispondere alle domande che avevano, " ha spiegato la dott.ssa Adriana Klyszejko, ricercatore post-dottorato presso l'eBIC che ha collaborato allo studio. "A Diamante, ciò che abbiamo creato è uno sforzo integrato per la nostra comunità di utenti in cui possono spingere ulteriormente la loro ricerca."

All'eBIC, il team ha ottenuto una struttura con una risoluzione di 3.4 Å. Dottor Woodward, elaborato:

"L'alta qualità dei dati che abbiamo ottenuto ci ha permesso di visualizzare per la prima volta la struttura di un filamento elicoidale di nitrilasi intatto con una risoluzione prossima a quella atomica. Abbiamo osservato un loop, tenuto in posizione dall'aminoacido che abbiamo scoperto, che limita la dimensione massima dei substrati legati e si sposta con torsione elicoidale."

Il sussidio START

Il lavoro è stato reso possibile con una borsa di studio sulle tecniche di sincrotrone per la ricerca e la tecnologia africana (START); un'iniziativa avviata nel marzo 2019 per costruire partenariati tra scienziati in Africa e nel Regno Unito. START è finanziato da una sovvenzione di 3,7 milioni di sterline dal Science and Technology Facilities Council (STFC) dell'UKRI dal Global Challenges Research Fund (GCRF). La STFC ha assegnato il finanziamento del GCRF, un fondo quinquennale da 1,5 miliardi di sterline che è una componente chiave nella realizzazione della strategia di aiuti del Regno Unito, garantire che la ricerca nel Regno Unito assuma un ruolo guida nell'affrontare i problemi affrontati dai paesi in via di sviluppo attraverso la ricerca e l'innovazione.

La motivazione per START deriva dalle sfide sociali affrontate dalle comunità africane; Per esempio, 600 milioni di persone (70%) nell'Africa subsahariana vivono senza elettricità, e una fornitura di elettricità affidabile è uno degli strumenti più potenti per sollevare le persone dalla povertà e porre fine alla loro dipendenza dagli aiuti. I ricercatori START studieranno i materiali energetici, comprese le strutture delle celle solari, catalizzatori e batterie. Lo sviluppo dell'assistenza sanitaria in Africa è ostacolato dalla mancanza di una comprensione fondamentale della causa di malattie come la malaria o l'HIV. La biologia strutturale fornisce informazioni senza precedenti sui meccanismi alla base di tali malattie.

Oltre a fornire accesso alle strutture di livello mondiale dell'eBIC agli scienziati del Sud Africa, la sovvenzione ha anche sostenuto lo scienziato post-dottorato, Dr. Andani Mulelu che era il ricercatore principale dello studio. "Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza questo, perché l'attrezzatura, il supporto e le infrastrutture necessarie per condurre con successo questo esperimento non sono disponibili in Africa, " ha spiegato il dottor Woodward.

Dott.ssa Gwyndaf Evans, Scienziato principale della linea di luce sulla linea di luce VMXm di Diamond, e Responsabile scientifico delle scienze della vita per il progetto START commenta:

"L'iniziativa START mira, tra l'altro, per aiutare a sviluppare competenze e capacità per la biologia strutturale in Africa. Inizialmente stiamo ponendo l'accento sulla facilitazione dell'accesso alle strutture di biologia strutturale di Diamond attraverso corsi di formazione mirati in Sud Africa e localmente qui a Diamond. L'obiettivo finale è dimostrare agli organismi di finanziamento africani il potere ei benefici della biologia strutturale nell'affrontare i problemi africani nella salute umana e nell'agricoltura per rendere la biologia strutturale un'attività sostenibile nel continente. Vedere esperti come Jeremy Woodward raggiungere una posizione di ruolo in Sudafrica è di buon auspicio per il futuro e aiuta in qualche modo a costruire questa sostenibilità".

Nitrilasi di design

Utilizzando le intuizioni ottenute dalla struttura crio-EM ad alta risoluzione, la squadra ha proiettato oltre 5, 000 mutanti per progettare un nuovo enzima con una torsione elicoidale alterata che agisca su una nuova serie di substrati non catalizzati da altre nitrilasi vegetali. Ciò è stato effettuato identificando gli amminoacidi "hotspot" per l'evoluzione diretta e selezionandoli accoppiando la sopravvivenza dei batteri alla conversione riuscita di una libreria di substrati.

Basandosi su questo lavoro, il team spera di mettere a punto le nitrilasi per realizzare il loro pieno potenziale biotecnologico. "Vorremmo arrivare al punto in cui possiamo produrre nitrilasi "designer" per qualsiasi substrato apportando le modifiche appropriate alla torsione elicoidale e alla tasca di rilegatura. Per raggiungere questo obiettivo, vorremmo visualizzare una raccolta di nitrilasi chiave con una gamma di diversi stati elicoidali (e specificità di substrato) mediante crio-EM ad alta risoluzione, " ha concluso il prof Woodward.