Il funzionamento della nanosonda a doppia canna per l'imaging SICM simultaneo e la misurazione del pH. Per gentile concessione di Comunicazioni sulla natura Credito:Università di Kanazawa
Le nanopipette con membrane zwitterioniche possono offrire un migliore monitoraggio delle variazioni di pH che circondano le cellule viventi, che possono indicare i tratti delle cellule tumorali invasive e la loro risposta al trattamento, rapporto ricercatori presso l'Università di Kanazawa in Comunicazioni sulla natura .
"Sta diventando chiaro che un pH acido extracellulare svolge un ruolo essenziale nella progressione delle cellule tumorali, invasività e resistenza alla terapia, " spiegano Yuri Korchev e Yasufumi Takahashi del Nano Life Science Institute dell'Università di Kanazawa e Yanjun Zhang dell'Imperial College di Londra e colleghi di istituzioni collaboratrici nel Regno Unito, Cina, Giappone e Russia in un recente articolo. Nonostante il crescente riconoscimento dell'importanza del pH che circonda direttamente una cellula come indicatore della salute cellulare, le tecniche per misurarlo rimangono limitate in termini di sensibilità, la risoluzione spaziale che possono offrire e la velocità di risposta alle variazioni di pH. Informare Comunicazioni sulla natura , Zhang, Takahashi e Korchev e colleghi descrivono un biosensore di pH a nanopipetta sensibile alle variazioni di pH inferiori a 0,01 unità con un tempo di risposta di 2 ms e una risoluzione spaziale di 50 nm.
I ricercatori hanno originariamente progettato il sensore come un transistor ad effetto di campo ionico per nanopipette, in cui le porte controllano il flusso di ioni nella nanopipetta anziché di elettroni. Però, mentre questo ha affrontato problemi relativi alla sensibilità al pH e alla risoluzione spaziale, le letture del dispositivo impiegavano ancora alcuni secondi per rispondere ai cambiamenti di pH dovuti agli effetti del blocco ionico di Coulomb che ostacolavano la velocità di diffusione degli ioni.
La soluzione Zhang, Takahashi e Korchev e colleghi ora propongono di incorporare una membrana zwitterionica per consentire risposte più rapide. Utilizzando una nanopipetta a doppia canna con la membrana in una sola delle canne, i ricercatori sono stati in grado di utilizzare l'altra canna come microscopio a scansione di conduttanza ionica (SICM) per misurazioni topologiche simultanee.
Il team ha testato il dispositivo su cellule tumorali vive e ha mostrato come il dispositivo potrebbe rilevare aumenti del pH extracellulare da fenotipi invasivi di cellule di cancro al seno che erano state private di estrogeni. Potrebbero anche rilevare i cambiamenti di pH delle alghe esposte alla luce solare, causato dall'assorbimento di carbonio inorganico nella fotosintesi, oltre a identificare le eterogeneità nelle cellule di melanoma aggressive da mappe di pH ad alta risoluzione.
Evidenziando la mappatura 3D dinamica controllata dal feedback in tempo reale del pH extracellulare che il loro strumento consente, e le eterogeneità delle cellule tumorali che può rilevare "senza etichetta e con risoluzione subcellulare" concludono, "Questo metodo potrebbe aiutare con la diagnosi del cancro, prognosi, e nella valutazione di terapie mirate a pHe acido [pH extracellulare]".
Mappatura pHe 3D ad alta risoluzione di cellule di melanoma viventi con nanosonda SICM-pH a doppia canna controllata da feedback. Le immagini topografiche 3D SICM (colonna sinistra) e le distribuzioni 3D pHe (colonna destra) del melanoma vivente a basso tampone A375M ottenute simultaneamente da una singola scansione SICM, che ha dimostrato un modello di distribuzione altamente variegato di pHe. Le barre della scala rappresentano 20 μm. Per gentile concessione di Comunicazioni sulla natura Credito:Università di Kanazawa
Limitazioni delle tecniche precedenti
Le sonde di pH attualmente più comunemente utilizzate si basano su microelettrodi piuttosto grandi rispetto alla scala delle fluttuazioni del pH di interesse negli studi sul pH extracellulare. Le alternative sono state basate sui cambiamenti nella fluorescenza delle molecole, risonanza magnetica nucleare e tomografia computerizzata a emissione di positroni. Però, il monitoraggio della fluorescenza è soggetto a rumore di fondo e photobleaching, e le altre tecniche hanno una scarsa risoluzione spaziale e presentano difficoltà di quantificazione perché si basano sulla distribuzione delle sonde all'interno dei tessuti.
Utilizzando una nanopipetta come transistor ad effetto di campo ionico, i ricercatori sono stati in grado di superare la maggior parte dei problemi che limitano le tecniche precedenti. Tuttavia, la repulsione della stessa carica reciproca porta all'effetto del blocco di Coulomb, che inizia a inibire la diffusione di molecole d'acqua protonate caricate positivamente nella nanopipetta e questo rallenta il tempo di risposta.
Membrana zwitterionica
Uno zwitterione è una molecola non carica contenente gruppi funzionali con carica opposta. Per la membrana zwitterionica nella nanopipetta i ricercatori hanno autoassemblato un idrogel da poli-l-lisina (PLL) e glucosio ossidasi (GOx), che presenta vantaggi in termini di costo e stabilità. Il PLL ha gruppi amminici quaternari carichi positivamente e il GOx ha un gruppo residuo di acido carbossilico caricato negativamente. La presenza di vapore di glutaraldeide può quindi reticolare l'idrogel PLL/GOx risultante.
A pH neutro la membrana zwitterionica presenta gruppi funzionali caricati sia positivamente che negativamente, ma in condizioni di pH basso dominano i gruppi amminici positivi in modo che gli anioni negativi diffondano preferenzialmente attraverso la membrana evitando un blocco ionico Coulomb.