Schema del doppio sistema di controllo della temperatura sviluppato da Gal4p, evoluzione diretta e regolazione dell'espressione per il miglioramento della produzione di isoprene. Credito:Jiaxi Lin
Il lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, è stato ampiamente ingegnerizzato per produrre una vasta gamma di sostanze chimiche che non sono prodotte naturalmente dal lievito, compreso l'importante monomero per la gomma sintetica, l'isoprene. Tuttavia, tutti gli organismi si sono evoluti naturalmente per una migliore sopravvivenza piuttosto che per massimizzare la biosintesi dei prodotti di interesse umano. S. cerevisiae non fa eccezione. Durante la sua ingegneria è stata osservata una crescita cellulare alterata mediante compartimentazione del percorso per una migliore biosintesi dell'isoprene.
Per affrontare questo problema, i ricercatori del College of Chemical and Biological Engineering dell'Università di Zhejiang hanno sviluppato un sistema di controllo dinamico sensibile alla temperatura per regolare il tempo di inizio della biosintesi dell'isoprene durante la fermentazione. Questo studio è stato pubblicato online in Frontiers of Chemical Science and Engineering .
L'attivatore trascrizionale nativo Gal4p di S. cerevisiae è stato progettato per aumentare la sensibilità alla temperatura e nel frattempo la sua espressione è stata guidata da un promotore di shock termico. In questo modo è stato sviluppato un doppio sistema di regolazione della temperatura, la cui applicazione ha portato a un'espressione limitata dei geni del percorso alla temperatura ottimale per la crescita cellulare (30 °C) e a una maggiore espressione genica quando la temperatura della coltura è stata commutata alla temperatura ottimale per sintesi di isoprene (37 °C).
Il mutante Gal4p "sensibile al freddo" che svolge il ruolo chiave di regolamentazione è stato creato dalla tecnologia di evoluzione diretta vincitrice del premio Nobel. Per facilitare la selezione rapida e accurata dei mutanti con sensibilità alla temperatura dalla libreria di mutanti casuali contenente migliaia di mutanti, è stato stabilito un metodo di screening ad alto rendimento indicato per la crescita basato sulla citotossicità della 5-fluorouridina formata dalla conversione catalizzata da URA3 di 5- acido fluoro-orotico. La correlazione negativa tra l'attività di Gal4p a una certa temperatura e la biomassa dei ceppi che accumulano 5-fluorouridina ha consentito la selezione di mutanti di Gal4p con attività inferiore a 30 ° C e attività maggiore a 37 ° C.
Quando il mutante Gal4p "sensibile al freddo" è stato espresso sotto il controllo di un promotore di shock termico, la sua attività di regolazione alla temperatura permissiva è stata ulteriormente aumentata a causa del livello di espressione potenziato e dell'espressione basale dei geni del percorso alla temperatura restrittiva è stato ulteriormente ridotto. L'impiego di questa doppia strategia di controllo della temperatura ha portato rispettivamente a miglioramenti del 34,5% e del 72% nella crescita cellulare e nella produzione di isoprene di S. cerevisiae. Questo studio riporta la creazione delle prime varianti sensibili al freddo di Gal4p per evoluzione diretta e fornisce un doppio sistema di controllo della temperatura per l'ingegneria del lievito che può anche essere favorevole alla biosintesi di altri prodotti naturali di alto valore. + Esplora ulteriormente
