19 F Metodo basato su NMR per il rilevamento dell'attività GEF Arf6. Credito:Wu Bo
Un gruppo di ricerca guidato dal Prof. Wang Junfeng dell'Hefei Institutes of Physical Science (HFIPS) dell'Accademia cinese delle scienze (CAS) ha sviluppato un nuovo fluoro unidimensionale (1D)-19 ( 19 F) metodo basato sulla risonanza magnetica nucleare (NMR) per il rilevamento rapido dell'attività del fattore di scambio del nucleotide della guanina Arf6 (GEF).
I loro risultati sono stati pubblicati in Chimica analitica il 6 giugno.
Le piccole GTPasi (sGTPasi) sono coinvolte nelle cascate di segnali che controllano un'ampia gamma di risposte cellulari. Tutte le sGTPasi possono essere trovate in due stati:uno stato inattivo in cui la piccola GTPasi è legata alla guanosina difosfato (GDP) e uno stato attivo in cui è legata alla guanosina trifosfato (GTP). Il ciclo della GTPasi formato dall'interconversione tra i due stati è strettamente regolato dai fattori di scambio dei nucleotidi della guanina (GEF) e dalle proteine attivanti la GTPasi (GAP).
La mutazione o la regolazione anormale delle proteine sGTPasi o dei rispettivi GEF/GAP sono strettamente correlate a molte malattie, incluso il cancro. Pertanto, è importante rilevare l'attività di queste proteine GEF/GAP sia in vitro che in vivo.
In questo studio, i ricercatori hanno incorporato l'amminoacido innaturale tfmF sito-specificamente in Phe47 di sGTPase Arf6, una posizione situata nel dominio di commutazione ARF6 la cui conformazione cambia maggiormente durante il ciclo GTPase. E hanno sviluppato 1D 19 F Metodo basato su NMR per rilevare l'attività del GEF nel sistema proteico purificato o in presenza dei lisati cellulari.
Per un test di attività GEF, il campione di Arf6-F47 tfmF caricato con GDP è stato inserito nello spettrometro il prima possibile dopo aver aggiunto un GEF e GTP. Una serie sequenziale di 19 1D Sono stati raccolti spettri F NMR. Il segnale di Arf6-F47 tfmF nello stato legato a GTP è stato elaborato e integrato. Le curve cinetiche di scambio sono state quindi tracciate e adattate a una curva di crescita esponenziale monofase per estrarre il tasso.
"Questa strategia potrebbe essere potenzialmente utilizzata per monitorare il cambiamento conformazionale di Arf6 o di altre sGTPasi", ha affermato Wu Bo, primo autore dello studio, "può rilevare le attività delle proteine regolatrici delle sGTPasi negli ambienti di fisiologia e patologia". + Esplora ulteriormente
