Ciò si ottiene utilizzando una pompa a vuoto per estrarre l'aria dalla camera, facilitando un'efficiente sterilizzazione a vapore. La libbra dell'autoclave indica la quantità di pressione, generalmente misurata in libbre per pollice quadrato (psi) o bar, che la pompa a vuoto può generare.
L'efficacia del processo di sterilizzazione dipende in larga misura dalla capacità di rimuovere l'aria dalla camera dell'autoclave. Poiché il vapore a temperature più basse è meno efficace nell'uccidere i microrganismi rispetto a temperature più elevate, è fondamentale rimuovere quanta più aria possibile per garantire che il vapore possa raggiungere tutte le superfici e penetrare negli oggetti avvolti o nei carichi porosi all'interno della camera.
I livelli tipici di vuoto o pressione negativa misurati nelle autoclavi durante il ciclo di sterilizzazione vanno da -13 a -30 psi (da -0,9 a -2,1 bar). Raggiungendo adeguati livelli di pressione negativa, il vapore può permeare rapidamente e sterilizzare efficacemente gli oggetti all'interno dell'autoclave.