Di Pete Collins | Aggiornato il 30 agosto 2022
L'elettroforesi separa le macromolecole come proteine e acidi nucleici in base alla dimensione, alla carica e ad altre proprietà fisico-chimiche. Nelle separazioni basate sulla carica, una soluzione tampone trasmette il campo elettrico e mantiene un pH stabile, preservando la carica nativa e la struttura degli analiti. Questa stabilità è fondamentale per una risoluzione accurata.
L'elettroforesi sfrutta un campo elettrico applicato (o un gradiente chimico in tecniche specializzate) per spostare le molecole cariche attraverso una matrice di gel. Le molecole migrano verso l'elettrodo di carica opposta:le specie cariche negativamente viaggiano verso l'anodo, le specie cariche positivamente verso il catodo. Poiché le molecole più grandi subiscono un maggiore attrito all’interno del gel, si muovono più lentamente di quelle più piccole, consentendo la separazione in base alle dimensioni. La distanza migrata può essere tracciata su scala logaritmica per stimare il peso molecolare o la lunghezza del frammento.
La DGGE introduce un gradiente denaturante, tipicamente una miscela di urea e formammide, all'interno del gel. Mentre i frammenti di DNA attraversano il gradiente, l’aumento delle concentrazioni di denaturante destabilizza progressivamente la doppia elica. Ogni frammento smette di migrare una volta che la concentrazione locale del denaturante raggiunge il punto di fusione. Questa tecnica sfrutta il comportamento di fusione dipendente dalla sequenza per risolvere frammenti di DNA di identica lunghezza ma sequenza diversa.
Nell'elettroforesi basata sulla carica, le specie ioniche del tampone conducono il campo elettrico applicato attraverso il gel, garantendo una distribuzione uniforme della corrente. Allo stesso tempo, la debole coppia acido-base del tampone mantiene il pH entro una finestra ristretta. Poiché lo stato di carica e la struttura tridimensionale delle proteine e degli acidi nucleici dipendono dal pH, un pH stabile previene cambiamenti conformazionali involontari che potrebbero compromettere la fedeltà della separazione.
La scelta del tampone giusto dipende dall'intervallo di pH desiderato e dalla necessità di ridurre al minimo la forza ionica, che altrimenti potrebbe generare calore e distorsione eccessivi. I buffer comunemente usati includono:
Per prestazioni ottimali, il pKa del buffer dovrebbe essere vicino al pH target e la forza ionica complessiva dovrebbe essere sufficientemente bassa da limitare il riscaldamento indotto dalla corrente pur consentendo un efficiente trasferimento di carica.
Selezionando e mantenendo attentamente le condizioni del tampone, i ricercatori possono ottenere separazioni riproducibili e ad alta risoluzione essenziali per le analisi a valle.
