Di Anne Mullenniex Aggiornato il 24 marzo 2022
Quantifica il tuo campione di RNA misurando la sua assorbanza della luce ultravioletta (UV). Uno spettrofotometro a nanogocce utilizzerà solo uno o due microlitri del campione, che potrai recuperare. Altri spettrofotometri richiedono un campione molto più grande. Il coefficiente di estinzione per i nucleotidi ad una lunghezza d'onda UV di 260 nm in un percorso luminoso di 1 cm è 20. In base a questo coefficiente di estinzione, l'assorbanza di 40 µg/ml di RNA nelle stesse condizioni è uno. Utilizzando queste informazioni, puoi calcolare la concentrazione del tuo campione di RNA.
Effettuare una diluizione, se necessario, del campione. Una diluizione standard per una microcuvetta è 1:40. Effettuare questa diluizione aggiungendo 2μL di campione di RNA a 78μL di acqua sterile.
Segui i protocolli del tuo specifico spettrofotometro per calibrare la macchina utilizzando un bianco e quindi determinare la densità ottica del campione a una lunghezza d'onda UV di 260 nm.
Moltiplicare l'assorbanza del campione per il fattore di diluizione di 40μg di RNA/mL. L'equazione sarebbe:"Concentrazione di RNA (μg/ml) =(OD260) x (fattore di diluizione) x (40μg RNA/ml)/(1 unità OD260)" (Hofstra.edu) Ad esempio:se diluissi il campione di 1:40 e la lettura dell'assorbanza fosse 0,08, moltiplicheresti 0,08 x 40 x 40 =128 µg/ml =0,13 µg/μL
Scopri la purezza del tuo campione eseguendo un'altra lettura di assorbanza alla lunghezza d'onda UV di 280 nm. Il rapporto OD 260/OD 280 indicherà se e a quale livello il campione è contaminato da proteine o fenoli. Un risultato compreso tra 1,8 e 2,0 indica RNA di qualità.
Non dimenticare di calibrare il tuo spettrofotometro. L'esecuzione di un rapido gel elettroforetico confermerà i risultati delle tue specifiche.
Non dare per scontato che il tuo campione sia puro. Prendersi il tempo necessario per un rapporto OD260/OD280 consente di risparmiare tempo e denaro in futuro.
