Di Andy Pasquesi
Aggiornato il 30 agosto 2022
Gli enzimi accelerano le reazioni chimiche riducendo l'energia di attivazione richiesta per la conversione del substrato. Il numero del fatturato, kcat , quantifica l'efficienza catalitica di un enzima misurando il numero di molecole di substrato convertite in prodotto per sito attivo dell'enzima al secondo in condizioni di substrato saturato.
Traccia la concentrazione del prodotto rispetto al tempo per la prima provetta del tuo test enzimatico. Utilizza il tempo sull'asse orizzontale e la concentrazione del prodotto sull'asse verticale.
Calcola la pendenza della porzione lineare della curva (velocità iniziale, V0 ). In Excel o in una calcolatrice grafica, la linea di regressione lineare ti fornirà direttamente la pendenza. Se preferisci una stima manuale, dividi la variazione nella concentrazione del prodotto tra due punti dati consecutivi per la variazione temporale corrispondente.
Registra questa pendenza come velocità di reazione iniziale, V0 , per quella provetta. Nell'equazione di regressione [Product] = m·time + b , il coefficiente m è V0 .
Ripeti i passaggi da 1 a 3 per ciascuna provetta del test per ottenere una serie di V0 valori a diverse concentrazioni di substrato.
Crea un grafico Lineweaver–Burk (doppio reciproco):traccia 1/[S] (concentrazione inversa del substrato) sull'asse orizzontale e 1/V0 (velocità iniziale inversa) sull'asse verticale. Ad esempio, se una provetta ha una concentrazione iniziale di substrato di 50 μM e un V0 di 80 μMs
–1
, il punto tracciato sarebbe (1/50 μM, 1/80 μMs
–1
).
Esegui una regressione lineare su questi punti. L'equazione risultante assume la forma 1/V0 = m·(1/[S]) + b , dove b è l'intercetta y.
Calcola l'inverso di Vmax prendendo il reciproco dell'intercetta y:1/Vmax = 1/b .
Invertire il valore del passaggio 3 per ottenere Vmax :
Vmax = 1/(1/Vmax) = b
Identificare la concentrazione dell'enzima utilizzata nel test (questo valore è costante in tutte le provette e deve essere riportato nei dati grezzi).
Calcola kcat dividendo Vmax dalla concentrazione dell'enzima:
kcat = Vmax / [E]
Ciò produce il numero di molecole di substrato convertite per sito attivo dell'enzima al secondo.
Seguendo questi passaggi sistematici:misurazione delle velocità iniziali, costruzione di un grafico Lineweaver-Burk, estrazione di Vmax e normalizzando la concentrazione dell'enzima:puoi determinare con precisione il numero di turnover di un enzima, kcat , un parametro fondamentale nell'enzimologia e nello sviluppo di farmaci.
