La fluorescenza è uno strumento incredibilmente utile per la biologia sperimentale ed è appena diventato più facile attingere, grazie al lavoro di un gruppo di ricercatori dell'Università di Chicago.

Il gruppo ha creato un nuovo strumento come parte di una classe di laboratorio all'interno del programma di laurea in Scienze biofisiche presso l'Università di Chicago, consentendo ai suoi utenti di concentrarsi sullo spettro da strutture specifiche all'interno dei campioni.

"La maggior parte del lavoro è stato svolto da studenti laureati durante il primo semestre, " ha detto Adam Hammond, direttore del curriculum e docente senior nel programma di scienze biofisiche presso il Gordon Center for Integrative Sciences. "Il loro entusiasmo e la loro creatività hanno reso possibile questo progetto."

Come riporta il gruppo questa settimana sul giornale Rassegna di strumenti scientifici , da AIP Publishing, l'obiettivo della loro strumentazione è osservare lo spettro di luce che proviene da una parte di un campione su un microscopio, ma non l'intero campione.

"Il valore di un microscopio è che permette di osservare le variazioni all'interno di un campione, "Ha spiegato Hammond. "Volevamo essere in grado di chiedere, 'qual è lo spettro di quella specifica struttura proprio lì?' Questo non è un nuovo desiderio e gli strumenti che possono farlo esistono, ma nessuno, per quanto ne so, semplicemente come il nostro."

Durante il suo primo anno di liceo, Peter Dahlberg, primo autore dell'articolo che ora è alla Stanford University in California, devo costruire un microscopio ad eccitazione selettiva. "Inconsciamente, Penso che l'idea sia iniziata allora, " ha detto. "Perché non fare la stessa cosa, ma al contrario?"

Come funziona lo strumento del gruppo? Primo, divide la luce che proviene da un campione. La metà va a una fotocamera per l'imaging normale e l'altra metà va a uno spettrometro. Ma prima che arrivi allo spettrometro, quella metà passa attraverso alcuni componenti ottici che consentono agli utenti di scegliere qualsiasi porzione arbitraria dell'immagine e bloccare tutto il resto.

"Non c'è niente di complicato in questi componenti ottici:un modulatore di luce spaziale (SLM) tra polarizzatori incrociati, "Ha detto Hammond. "Gli SLM sono comuni ora, con almeno tre su molti moderni proiettori digitali. Hanno una serie di pixel che possono manipolare ciascuno la fase della luce che li attraversa".

Sebbene ci siano diversi trucchi che puoi fare con un SLM, il gruppo sta usando quello più diretto.

"Focalizziamo l'immagine del campione sull'SLM e spostiamo la fase solo di quei pixel da cui vogliamo ottenere uno spettro, " continuò. "La luce spostata passa attraverso un secondo polarizzatore; tutto il resto viene bloccato. Quindi quella luce viene raccolta e può essere inviata a qualsiasi tipo di strumento ottico che scegli. In questo momento lo inviamo a un piccolo spettrometro UV/Vis per ottenere uno spettro completo".

Lo strumento del gruppo è, forse, meglio riassunto come uno "strumento cavallo di battaglia". I suoi semplici concetti e componenti possono essere facilmente adattati per molti scopi diversi e aggiunti ai microscopi esistenti in modo semplice ed economico.

"Abbiamo deciso di costruirlo per un uso specifico:misurare lo spostamento spettrale degli indicatori fluorescenti, "Ha detto Hammond. "Non abbiamo davvero pensato di renderlo versatile o come organizzare l'SLM e i polarizzatori quando abbiamo iniziato. Ma abbiamo avuto una piacevole serie di realizzazioni lungo la strada".

Una di queste realizzazioni era che il loro strumento poteva essere utilizzato anche per le misurazioni dell'assorbanza.

"Spesso, i campioni più importanti sono minuscoli e difficili da creare o purificare, come forme cristalline, " ha detto. "È un lavoro arduo purificare i due tipi distanti l'uno dall'altro in quantità sufficienti per riempire una cuvetta. Quando metti la miscela su un vetrino da microscopio, diventa più facile. I cristalli possono essere misurati uno alla volta, e così anche le cellule che esprimono cromofori variabili (molecole responsabili del colore). Questo apre un'area completamente nuova che non faceva parte del nostro piano originale".

Lo strumento del gruppo può "prendere l'intero spettro di una o più regioni di interesse definite dall'utente catturando simultaneamente immagini di fluorescenza standard dell'intero campo visivo, "Ha detto Hammond. "Quindi quello che puoi fare con esso dipende dal campione. Lo stiamo usando ora per seguire le sonde fluorescenti per pH e calcio. Ma un esempio di un'applicazione molto diversa è la sua capacità di identificare i singoli microrganismi all'interno di un campione misto in base alla loro impronta digitale di assorbanza".

Qual è il futuro per i ricercatori?

"Utilizzando una sorgente di eccitazione pulsata, la durata della fluorescenza di una sonda potrebbe essere misurata da una regione di interesse selezionata, " ha detto Hammond. "Un'interessante potenziale applicazione è nel campo delle neuroscienze per la risoluzione dei singoli potenziali d'azione con coloranti sensibili al potenziale di membrana. Le misurazioni della durata della fluorescenza offrono un vantaggio rispetto alle misurazioni dirette della fluorescenza perché sono indipendenti dalla concentrazione della sonda".