La radiografia adatta, protocollo dell'agente di colorazione specifico del nucleo per l'istologia virtuale 3D. Protocollo di colorazione e interazione della colorazione radiografica a base di emateina con i tessuti molli. (A) La procedura di colorazione a base di emateina sviluppata mostra i singoli passaggi coinvolti, inclusi i tempi di incubazione e colorazione. La fase 1 di colorazione è stata condotta utilizzando piombo(II) acetato triidrato come fonte di metallo pesante. Il piombo (II) acetato triidrato è stato sciolto in acqua distillata ed è indicato come soluzione di lavoro (A) (WS (A)). La fase di colorazione 2 prevedeva una soluzione di emateina in etanolo assoluto (WS (B), 10% (p/v); c = 333 mM), che è stato derivato dall'ematossilina ed è stato aggiunto a WS (A). (B) Il complesso emateina piombo (II) caricato positivamente (viola), che è costruito in situ nel campione di tessuto molle, interagisce con lo scheletro fosfatico caricato negativamente del DNA (arancione) presente nel nucleo della cellula. L'interazione selettiva del complesso dell'emateina piombo (II) con il DNA è ottenuta mediante acidificazione del tessuto molle durante la fissazione o prima della colorazione e consente un maggiore accumulo del complesso dell'emateina piombo (II) all'interno del nucleo cellulare. Credito: Rapporti scientifici , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y
L'istologia viene utilizzata per identificare i dettagli strutturali del tessuto su microscala nel laboratorio di patologia, ma le analisi rimangono bidimensionali (2D) in quanto limitate allo stesso piano. Le tecnologie 3D non distruttive, tra cui la micro e nano tomografia computerizzata a raggi X (nanoCT), hanno dimostrato validità per comprendere le strutture anatomiche, poiché consentono angoli di visualizzazione arbitrari e dettagli strutturali 3D. Però, la bassa attenuazione dei tessuti molli ha ostacolato la loro applicazione nel campo dell'istologia virtuale 3D. In un recente studio, ora pubblicato su Rapporti scientifici , Mark Müller e i colleghi del Dipartimento di Fisica e Bioingegneria hanno sviluppato un metodo di colorazione a raggi X a base di emateina per colpire specificamente i nuclei cellulari, seguite da dimostrazioni su un intero lobulo epatico di un topo.
Il nuovo protocollo di colorazione ha combinato il recente sviluppo, sistema nanoCT ad alta risoluzione per la visualizzazione 3D dell'architettura tissutale su scala nanometrica. I risultati hanno rivelato la reale morfologia 3D insieme alla distribuzione spaziale dei nuclei cellulari. La tecnica era anche compatibile con l'istologia convenzionale, poiché i vetrini microscopici con campioni di tessuto molle potrebbero essere colorati con lo stesso protocollo insieme a un'ulteriore controcolorazione. Il metodo ha dimostrato la possibilità di future applicazioni in istopatologia accompagnate da dispositivi TC a raggi X in laboratorio.
L'istologia è il gold standard esistente per un'accurata diagnosi microanatomica nel laboratorio di patologia, tuttavia tecniche e risultati sono limitati al 2D. Ad esempio, una biopsia 3D viene solitamente esaminata utilizzando vetrini microscopici molto sottili (contenenti fette spesse 2-10 µm) tramite tecniche di colorazione immunoistochimica e istologica convenzionali e moderne. Micro e nano-TC sono strumenti potenti in grado di fornire un'accurata ricostruzione del tessuto in 3D. Gli sviluppi della tecnologia hanno consentito una risoluzione relativamente alta dell'istologia convenzionale 2D esistente, utilizzando dispositivi che vanno dai grandi acceleratori di particelle ai dispositivi a raggi X di laboratorio.
Accanto ai requisiti tecnici, Agenti di colorazione idonei ai raggi X (mezzi di contrasto) come acido fototungstico (PTA), ioduro di potassio (IKI), iodio in etanolo (12E), o lo iodio in metanolo (12M) sono importanti. Gli agenti coloranti disponibili sono tuttavia, attualmente limitato per portata ed efficacia. Quando si sviluppa la diagnostica medica di nuova generazione in istopatologia, gli scienziati mirano a ottimizzare le tecniche ea comprendere l'architettura dei tessuti dal livello cellulare alla scala tissutale.
Fette TC dello stesso intero lobulo epatico di topo prima e dopo la colorazione evidenziando il miglioramento del contrasto ottenuto dopo l'applicazione della macchia a raggi X a base di emateina. Entrambi i set di dati sono stati acquisiti con il microCT Xradia Versa 500 utilizzando parametri di acquisizione identici. La dimensione dei voxel in entrambi i set di dati è 13,5 µm. (UN, C ed E) Panoramica delle immagini del lobulo di fegato di topo non colorato che rappresenta le viste lungo gli assi cartesiani. (B, D e F) Panoramica delle immagini dello stesso campione di lobulo epatico di topo in (A, C ed E) dopo la colorazione che rappresentano le viste lungo gli assi cartesiani. Vengono visualizzate strutture anatomiche come il sistema vascolare. Credito: Rapporti scientifici , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Durante la prima diagnosi in patologia clinica, i nuclei cellulari e il citoplasma sono importanti. Quasi ogni campione istologico viene quindi spesso colorato tramite il protocollo standard di ematossilina ed eosina (H&E) per identificare i nuclei e il citoplasma. Ma gli standard per la colorazione dell'ematossilina non sono fissi ed esistono molte varianti al protocollo a causa dei diversi tipi di tessuto e/o dei parametri di pre-trattamento coinvolti. Di conseguenza, Muller et al. introdotto un protocollo di colorazione a base di emateina, sviluppato specificamente per TC, per consentire la visualizzazione 3D diretta dei nuclei cellulari nei campioni di tessuto molle. Il potente potenziale di microCT o nanoCT combinato con macchie adatte ai raggi X consentirà futuri approfondimenti sull'organizzazione dei tessuti per comprendere malattie tra cui l'osteoartrite e il cancro, alla nanoarchitettura cellulare.
Quando si sviluppa la nuova radiografia adatta, colorante a base di emateina, l'ematossilina di Mayer comunemente usata e l'ematossilina di ferro di Wiegert sono state incluse nella sua costituzione. Gli esperimenti di colorazione sono stati condotti sul tessuto del lobulo epatico di topo, utilizzato per l'imaging TC a raggi X in seguito. Il protocollo di colorazione ottimizzato conteneva cinque passaggi che iniziavano con l'acidificazione controllata dei campioni di tessuto molle durante la fissazione. Il tessuto molle è stato preparato a livello molecolare per la colorazione con il complesso emateina piombo (II).
Nel suo meccanismo d'azione, gli scienziati hanno mostrato un'interazione ionica rafforzata tra il complesso emateina piombo (II) caricato positivamente e lo scheletro fosfato caricato negativamente dell'acido desossiribonucleico (DNA). La reazione chimica ha assicurato un maggiore accumulo dell'agente colorante all'interno dei nuclei cellulari formando un complesso di DNA di piombo emateina (II), come agente adatto ai raggi X.
Dati NanoCT (A–C) rispetto al vetrino istologico microscopico (D) derivato dallo stesso lobulo epatico di topo dopo l'applicazione del protocollo di colorazione a raggi X a base di emateina. È stata ottenuta una chiara visualizzazione dei nuclei delle cellule degli epatociti più grandi e dei nuclei delle cellule più piccole come le cellule di Kupffer e le SEC in bianco (A–C) o viola scuro (D) e la rete BC visualizzata in nero (A-C) o bianco (D), rispettivamente. (A) Il volume di interesse (VOI) che evidenzia le due sezioni nanoCT mostrate in (B, cornice blu) e (C, cornice arancione). (B, C) singole fette nanoCT rappresentative come indicato nel VOI da (A). (B) e (C) sono ortogonali tra loro. L'orientamento della rete BC, che è formato dagli epatociti si vede, cioè una disposizione più orizzontale è vista in (B) e un allineamento più verticale in (C). Lo spessore della fetta nanoCT è di 580 nm. (D) Vetrino microscopico istologico rappresentativo con uno spessore di 3μm ottenuto dallo stesso campione di lobulo epatico del topo dopo aver applicato la macchia a base di emateina e averlo incorporato in un blocco di paraffina. Credito: Rapporti scientifici , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Per confrontare l'efficacia della colorazione, il tessuto del lobulo epatico di topo è stato ripreso con microCT prima della colorazione, seguita dall'imaging dopo la colorazione basata sul protocollo dell'emateina. Il processo di colorazione è avvenuto in due fasi e il miglioramento del contrasto desiderato è stato ottenuto come previsto dopo la colorazione. I risultati sono stati osservati utilizzando la panoramica microCT per mostrare strutture anatomiche distinte, compreso il sistema vascolare. La colorazione era omogenea all'interno dell'intero lobulo epatico di topo, a differenza degli esempi precedenti in campioni di tessuto epatico di grandi dimensioni. Il processo di imaging 3D ha consentito l'accessibilità a una serie di sezioni TC su piani arbitrari. Per di più, a differenza dell'istologia 2D convenzionale (con tessuti molli inclusi in paraffina), il tessuto molle potrebbe essere visto da diverse angolazioni.
Il tessuto è stato successivamente studiato a livello subcellulare con pezzi più piccoli dello stesso lobulo epatico, che sono stati sezionati e analizzati utilizzando nanoCT. I risultati visualizzati hanno mostrato regioni del volume di interesse (VOI), nuclei cellulari degli epatociti e nuclei di altri tipi cellulari (cellule di Kupffer e cellule endoteliali sinusoidali). Intere strutture nere rappresentavano la rete biliare canalicolare (BC), mentre i valori grigi più scuri indicavano il citoplasma del campione di tessuto epatico. È stato inoltre osservato l'orientamento della rete BC. Il tessuto è stato quindi studiato con l'istologia convenzionale, utilizzando vetrini microscopici molto sottili senza altra colorazione oltre alla colorazione a base di emateina applicata. La tecnica convenzionale ha confermato analogamente la morfologia degli epatociti e di altri tipi cellulari (nuclei colorati in viola scuro), mentre la rete aC è stata macchiata di bianco.
Nuclei 3D e analisi di diversi nuclei cellulari presenti nel volume di interesse del fegato di topo (VOI). Credito: Rapporti scientifici , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Gli scienziati hanno comparativamente confermato l'accuratezza della ricostruzione dei dati 3D nello studio con indagini precedenti. Quando la procedura a base di emateina è stata riapplicata nelle indagini istologiche 2D convenzionali, gli scienziati hanno anche applicato un contro-macchia standard, eosina Y specifico, al citoplasma cellulare sul tessuto. Nei risultati, i nuclei delle cellule sono rimasti viola mentre il citoplasma ha assunto la colorazione rosa. In questo modo, gli scienziati hanno autenticato anche la capacità di colorazione basata sull'emateina specifica dei nuclei con l'istologia standard.
Dimostrazione della compatibilità istologica del metodo di colorazione a base di emateina sviluppato per microCT a raggi X e nanoCT con l'istologia 2D convenzionale. (A) Vetrino microscopico istologico rappresentativo con uno spessore di 3μm ottenuto dallo stesso campione di lobulo epatico di topo dopo la colorazione a base di emateina applicata e l'inclusione in un blocco di paraffina. Visualizzazione chiara dei nuclei delle cellule degli epatociti più grandi e dei nuclei delle cellule più piccole come le cellule di Kupffer e le SEC in viola scuro e la rete BC visualizzata in bianco. (B) La compatibilità con la controcolorazione standard dell'eosina Y è stata mostrata su un successivo vetrino microscopico visto in (A). I nuclei cellulari sono mostrati in viola accanto al citoplasma in rosa, risultando in un tipico vetrino microscopico colorato con H&E di un campione di tessuto molle. Credito: Rapporti scientifici , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Il protocollo di colorazione a base di emateina ha aiutato la visualizzazione TC ad alta risoluzione per i nuclei cellulari nei tessuti molli nell'intervallo sub-micron, finora non possibile con altri metodi di colorazione combinati con la tecnologia microCT. I futuri studi istopatologici potrebbero essere in grado di eliminare le lunghe procedure di preparazione e la perdita di campioni di tessuto (come si osserva con l'istologia standard) per ottenere singole sezioni di tessuto tramite l'indagine 3D di un intero VOI, come dimostrato nel presente studio. La capacità di esaminare un campione più ampio per i nuclei cellulari anormali potrebbe aiutare i patologi a identificare le regioni di infiammazione per valutare l'eziologia e la progressione della malattia.
Il protocollo di colorazione è semplice e riproducibile, adatto per la colorazione TC di tutto l'organo, accoppiato con visualizzazione 3D e approfondimento, analisi non distruttiva di campioni di tessuti molli. Gli agenti coloranti elencati nel protocollo sono facilmente accessibili, mentre il protocollo adatto alla radiografia combinata TC consente una maggiore sofisticazione per le analisi dei campioni di tessuto molle. Le fasi del protocollo di colorazione richiederanno un'ulteriore ottimizzazione con diversi tipi di tessuto e in diverse applicazioni, compresa l'istologia 3D, studi di biologia dello sviluppo e strutturale in laboratorio.
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