I ricercatori hanno sviluppato un microscopio specifico per l'imaging di grandi gruppi di cellule interagenti nei loro ambienti naturali. Lo strumento fornisce agli scienziati un nuovo strumento per l'imaging dei neuroni negli animali viventi e potrebbe fornire una visione senza precedenti di come le grandi reti di neuroni interagiscono durante i vari comportamenti.
In ottica , La rivista della Optical Society per la ricerca ad alto impatto, ricercatori della Boston University, Gli Stati Uniti mostrano che il loro nuovo sistema di microscopia confocale "multi-z" può visualizzare il cervello di topi viventi a velocità video e con un campo visivo più grande di un millimetro.
L'imaging di grandi gruppi di cellule richiede l'acquisizione di dettagli cellulari o subcellulari a velocità elevate su un grande volume 3D. Questo è difficile perché la maggior parte degli approcci di imaging presenta compromessi intrinseci tra velocità, campo visivo e risoluzione.
"Abbiamo trovato un modo per unire le funzionalità di imaging necessarie in un sistema di microscopia facile da costruire e utilizzare, " disse Amaury Badon, primo autore del saggio. "Fornisce inoltre risultati in tempo reale senza la necessità di complicate analisi dei dati o elaborazione delle immagini".
Acquisizione di volumi di immagini 3D
Il nuovo microscopio si basa sulla microscopia confocale, una tecnica comunemente usata per l'imaging cellulare. La microscopia confocale produce immagini ad alta risoluzione e contrasto utilizzando un foro stenopeico fisico per bloccare la luce fuori fuoco e far passare la luce a fuoco. Però, la scansione di un campione per acquisire un numero sufficiente di immagini 2D per ricostruire un volume 3D richiede molto tempo e produce grandi quantità di dati.
Per acquisire più piani contemporaneamente, i ricercatori hanno sviluppato un modo per riutilizzare la luce per l'imaging delle cellule su un piano per visualizzare anche le cellule più in profondità nel campione. Hanno usato un approccio chiamato illuminazione estesa in cui la lente dell'obiettivo del microscopio è solo parzialmente riempita con la luce illuminante, permettendo alla luce di penetrare più in profondità nel campione. L'obiettivo completo viene quindi utilizzato per rilevare la fluorescenza, che fornisce alta risoluzione. Piuttosto che avere un foro stenopeico, come le tradizionali configurazioni confocali, il nuovo microscopio ha una serie di fori riflettenti che catturano ciascuno la luce a fuoco da una diversa profondità all'interno del campione.
"Il nostro metodo beneficia del contrasto della microscopia confocale pur essendo in grado di estendersi all'imaging volumetrico senza sacrificare la velocità, " disse Badon. "Anche se l'illuminazione estesa e i fori riflettenti sono stati usati prima, questa è la prima volta che sono stati combinati in un microscopio confocale in modo efficiente dalla luce."
I ricercatori hanno anche adattato il microscopio per l'imaging su scala più ampia rispetto ai microscopi confocali convenzionali e lo hanno progettato per l'immagine a velocità video. L'acquisizione rapida dell'immagine era importante perché gli indicatori di fluorescenza che monitorano la funzione cellulare in genere operano su scale temporali di poche decine di millisecondi.
Imaging dell'attività neurale negli animali vivi
I ricercatori hanno dimostrato il sistema di microscopia confocale multi-z utilizzandolo per visualizzare interi vermi di C. elegans, che sono troppo grandi (da 500 a 800 micron di lunghezza) per poter essere facilmente ripresi tutti in una volta con un microscopio confocale tradizionale. Hanno rilevato e monitorato simultaneamente l'attività di 42 neuroni nell'intero organismo, anche quando i vermi si muovevano.
Hanno quindi usato il loro microscopio per visualizzare la regione dell'ippocampo del cervello di un topo in un animale sveglio la cui testa è stata tenuta ferma. Sono stati in grado di visualizzare l'attività dei neuroni all'interno di un volume che misura 1200 X 1200 X 100 micron a velocità video. Utilizzando un algoritmo, i ricercatori sono stati in grado di identificare 926 neuroni nel volume ripreso.
Ora stanno lavorando per migliorare la velocità e la profondità di penetrazione della tecnica e per rendere il microscopio il più versatile e facile da usare possibile.
