Configurazione NMR pre-polarizzazione microfluidica. (A) Confronto della polarizzazione statistica e termica dei protoni nell'acqua in funzione del volume di rilevamento. La densità di protoni dell'acqua a temperatura ambiente è ρ =6,7 × 1028 m-3. (B) Concetto di prepolarizzazione. L'analita viene prepolarizzato facendolo fluire attraverso un magnete permanente (array Halbach da 1,5 T). Successivamente viene inviato a un chip microfluidico alloggiato in un contenitore stabilizzato, campo magnetico inferiore (B0 =13 mT, bobine di Helmholtz) dove viene rilevato da NV NMR. (C) Configurazione del rilevamento. L'analita prepolarizzato scorre verso un chip microfluidico dove viene fermato tramite interruttori fluidici (non mostrati), e il segnale NV NMR viene rilevato utilizzando un microscopio a epifluorescenza personalizzato con un'apertura numerica (NA) di 0,8. Un set di otto bobine di compensazione del gradiente viene utilizzato per eliminare i gradienti di campo magnetico di primo e secondo ordine lungo la direzione del campo. Il campo viene stabilizzato temporaneamente utilizzando un magnetometro NMR basato su bobina in combinazione con bobine di feedback a bassa induttanza avvolte attorno alle bobine principali di Helmholtz. (D) Configurazione del chip microfluidico. Il chip è costruito utilizzando vetro e adesivi. Due linee fluidiche passano alla regione di rilevamento, uno costituito da acqua (per magnetometro a bobina NMR) e l'altro con analita (per NV NMR). Un circuito di eccitazione a radiofrequenza (RF), posizionato tra il magnetometro della bobina NMR e il sensore NV NMR, eccita la coerenza dello spin nucleare in entrambi i canali. Il magnetometro a bobina NMR è costituito da una bobina di 3 mm di diametro avvolta attorno a un volume d'acqua 10-μl. L'anello di eccitazione RF e il magnetometro a bobina NMR sono stati posizionati ortogonalmente l'uno all'altro per ridurre al minimo la diafonia. Linee a microonde in rame (MW), stampato all'interno della scheggia di vetro, fornire il controllo dello spin sugli spin degli elettroni NV. (E) Geometria NV NMR. Una membrana diamantata drogata con NV (1 mm x 1 mm x 0,035 mm) si trova sulla superficie di un canale microfluidico (larghezza:2 mm, altezza:tra 0,2 mm e 1 mm) a contatto con l'analita. L'illuminazione laser (532 nm) rimbalza sulla linea delle microonde stampata, e viene rilevata la fluorescenza (da 650 a 800 nm). Il volume effettivo di rilevamento dell'analita è ∼40 pL. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.aaw7895
I sensori quantistici basati su centri di azoto vacante (NV) nel diamante sono una modalità di rilevamento promettente per la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare grazie al loro volume di rilevamento su scala micron e ai requisiti di rilevamento del campione non induttivo. Una sfida che esiste è quella di realizzare sufficientemente un'elevata risoluzione spettrale unita alla sensibilità alla concentrazione per l'analisi NMR multidimensionale di volumi di campioni di picolitri. In un nuovo rapporto ora su Progressi scientifici , Janis Smits e un team di ricerca interdisciplinare nei dipartimenti di High Technology Materials, Physics and Astronomy negli Stati Uniti e in Lettonia ha affrontato la sfida separando spazialmente le fasi di polarizzazione e rilevamento dell'esperimento in una piattaforma microfluidica.
Hanno realizzato una risoluzione spettrale di 0,65±0,05 Hz, un miglioramento dell'ordine di grandezza rispetto ai precedenti studi NMR sui diamanti. Utilizzando la piattaforma, hanno eseguito la spettroscopia di correlazione 2-D di analiti liquidi con un volume di rilevamento effettivo di ~ 40 picolitri. Il team di ricerca ha utilizzato sensori quantistici di diamante come rivelatori NMR microfluidici in linea in un importante passo avanti per le applicazioni nell'analisi chimica a massa limitata e nella biologia unicellulare.
La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica potente e ben consolidata per la composizione, analisi strutturale e funzionale in una varietà di discipline scientifiche. Nella spettrometria NMR convenzionale il rapporto segnale-rumore (SNR) è fortemente dipendente dall'intensità del campo esterno (B 0 ). All'aumentare della risoluzione spettrale, il B 0 anche aumentato, motivare lo sviluppo di magneti superconduttori sempre più grandi e costosi per una migliore risoluzione e SNR, con conseguente aumento di due volte dell'intensità di campo negli ultimi 25 anni.
Però, anche con B large grande 0 valori, il rilevamento di volumi su microscala spesso richiedeva l'etichettatura isotopica, campioni concentrati e lunghe tempistiche sperimentali. Per migliorare la sensibilità per piccoli volumi di campione, ricercatori hanno sviluppato bobine induttive in miniatura, che ha permesso diversi progressi, compresa la spettroscopia delle cellule uovo e la diagnostica in vitro. I limiti di sensibilità e rilevamento esistenti sono ancora subottimali per l'analisi metabolica di singole cellule di mammifero o per l'inclusione in saggi microfluidici in linea. Come strategia di rilevamento NMR alternativa, sensori quantistici basati su centri di azoto vacante (NV) nel diamante sono emersi grazie alla loro risoluzione spaziale sub-micrometrica e al rilevamento non induttivo.
Ampiezza di proiezione del campo magnetico in ca nucleare (integrata nel volume del sensore) in funzione del volume dell'acqua. Il volume di rilevamento effettivo (∼40 pL ) è definito come il volume in cui l'ampiezza della proiezione del campo nucleare in corrente alternata è pari alla metà di quella del volume totale effettivo del campione. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.aaw7895
Gli scienziati hanno precedentemente implementato il metodo per rilevare le prime fluttuazioni su nanoscala della magnetizzazione nucleare per migliorare la polarizzazione. Hanno usato solventi viscosi per migliorare la risoluzione in frequenza a ~ 100 Hz per ottenere la risoluzione di grandi spostamenti chimici a B 0 =3T (Tesla). Sebbene sia possibile apportare ulteriori miglioramenti alla risoluzione aumentando il volume di rilevamento (V), hanno avuto un costo per SNR. Nel presente lavoro, Smit et al. segnalare un miglioramento dell'ordine di grandezza nella risoluzione spettrale per realizzare una sensibilità alla concentrazione di ~ 27 M s 1/2 . Per realizzare questo, hanno separato spazialmente le fasi di polarizzazione e rilevamento dell'esperimento in una configurazione microfluidica.
Il team di ricerca ha utilizzato potenti magneti permanenti (1,5 Tesla) per generare la polarizzazione dello spin nucleare ed ha eseguito il rilevamento a 13 mT utilizzando bobine di Helmholtz per semplificare il compito di stabilizzare le larghezze di riga NMR a livelli sub-hertz. Hanno facilitato l'uso di sensori quantistici a diamante come rivelatori NMR microfluidici in linea a basse frequenze delle microonde. I miglioramenti hanno permesso a Smits et al. per eseguire la spettroscopia di correlazione bidimensionale (2-D) (COSY) di analiti liquidi entro un volume di rilevamento effettivo di ~ 40 pL (pico-litri). I ricercatori intendono combinare questa piattaforma con i progressi nella polarizzazione nucleare dinamica utilizzando agenti polarizzanti esterni e potenzialmente iperpolarizzazione ottica con centri NV per consentire la spettroscopia NMR dei metaboliti a concentrazioni fisiologiche a risoluzione spaziale di una singola cellula.
Nella configurazione sperimentale, Smit et al. alloggiava gli analiti fluidi in un contenitore pressurizzato ad elio con portate variabili fino a 50 µl/s. Il tempo di permanenza degli analiti è di circa 6 secondi, più lungo del tempo di rilassamento dello spin degli analiti studiati (ad esempio T 1 per l'acqua ≈ 3s) che porta ad una polarizzazione di equilibrio di ~ 5x10 -6 . L'analita è quindi fluito in una regione di rilevamento per l'identificazione mediante NV NMR. Per condurre il rilevamento NV NMR, gli scienziati hanno utilizzato un microscopio a epifluorescenza su misura e membrane di diamante orientate fabbricate nello studio, su quattro possibili assi NV per allinearsi con il campo magnetico nel setup.
Caratterizzazione di NV NMR prepolarizzati. (A) La sequenza di impulsi di lettura sincronizzata. Consiste in un treno di impulsi XY8-N che effettuano misurazioni di fase successive del campo magnetico alternato prodotto dall'elaborazione dei nuclei. La fluorescenza misurata riflette una versione con alias della proiezione del campo nucleare in corrente alternata. L'intera sequenza viene ripetuta ogni 2,5-4,25 s (1,25 s per il flusso e il resto per il rilevamento). (B) spettri NV NMR (valore assoluto della trasformata di Fourier) dell'acqua (rosso) e un campo di prova di ampiezza 2,5 nT applicato (blu) per un tempo di acquisizione effettivo di 5,2 s (media di 60 tracce; tempo di misurazione totale, 150 secondi). L'ampiezza del segnale NMR ottenuto dal segnale del fotorilevatore elaborato viene registrata in μV. La conversione in ampiezza del campo magnetico (in nT) è derivata dal campo di prova calibrato. Riquadro:La SD del rumore di fondo rivela aBmin =45 pT. Da questi dati, deduciamo una concentrazione minima rilevabile di 27 M s1/2 (SNR =3). Incorporando tutti i tempi morti sperimentali, la sensibilità alla concentrazione è ∼45 M s1/2. (C) Uno spettro NV NMR ad alta risoluzione dell'acqua (parte immaginaria della trasformata di Fourier) rivela un'intera larghezza a metà larghezza massima (FWHM) di 0,65 ± 0,05 Hz. I dati sono stati ottenuti con una media di 60 tracce, ogni 3 s di lunghezza. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.aaw7895
Smit et al. fabbricato il chip microfluidico per alloggiare il sensore di diamante, il dispositivo conteneva un chip di rame su un vetrino per erogare le microonde. Gli scienziati hanno anche incluso un circuito di eccitazione a radiofrequenza (RF) tra il diamante e la bobina NMR di feedback, e un canale microfluidico che racchiude il sensore di diamante e l'analita di contatto. Hanno progettato porte microfluidiche per combinare tubi di analita esterni all'interno del chip e hanno utilizzato un raggio laser di 20 µm di diametro per eccitare i centri NV attraverso una membrana diamantata di 35 µm di spessore.
Il team di ricerca ha successivamente applicato una serie di sequenze di impulsi a microonde XY8-5 al centro NV per rilevare il campo nucleare in corrente alternata. Hanno usato acqua deionizzata per determinare i limiti di sensibilità e risoluzione spettrale dell'apparato. Per ottimizzare la risoluzione spettrale, hanno regolato le bobine di compensazione del gradiente e hanno dimostrato le capacità dello spettrometro NV NMR ottenendo spettri NMR protonici di diversi analiti di fluidi.
Per esempio, gli scienziati hanno ottenuto spettri NV NMR caratteristici per il trimetilfosfato (TMP) e 1, Composti 4-difluorobenzene (DFB) nello studio. Dopo aver stabilito il potenziale per rilevare spettri NMR con risoluzione sub-hertz e rapporti segnale-rumore elevati (SNR) per i due composti, hanno usato la piattaforma per eseguire la spettroscopia 2-D COSY NMR. Per questo, Smit et al. eseguito due varianti dell'analisi COSY 2-D per sondare le interazioni nucleari all'interno di DFB (1, 4-difluorobenzene) ed eseguito tutte le simulazioni utilizzando il pacchetto software SPINACH per 2-D NMR.
1D NMR. Segnali NV NMR nel dominio del tempo (a sinistra) e nel dominio della frequenza (a destra) per (A) acqua, (B) trimetilfosfato (TMP), e (C) 1, 4-difluorobenzene (DFB). I segnali sono stati mediati su ∼103 tracce per un'acquisizione totale di ∼1 ora. Ai dati nel dominio del tempo viene applicato un filtro passa-banda 1-kHz per una migliore visualizzazione. Gli spettri nel dominio della frequenza mostrano la componente immaginaria della trasformata di Fourier. Ogni spettro è compatibile con le funzioni gaussiane (linee nere). Per TMP, vincoliamo le larghezze di entrambe le linee ad essere uguali con un rapporto di ampiezza 1:1 e troviamo JHP =11,04 ± 0,06 Hz. Per DFB, limitiamo le larghezze di tutte e tre le linee ad essere uguali con un rapporto di ampiezza 1:2:1 e troviamo JHF¯=6.09±0.05 Hz. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.aaw7895.
La risoluzione sub-hertz dimostrata e le tecniche NMR multidimensionali possono aprire la strada all'uso di sensori quantistici a diamante all'interno dell'analisi con trattino in linea, metabolomica unicellulare e farmacodinamica a massa limitata. Smit et al. puntare all'elevata risoluzione spaziale e al formato di epifluorescenza che ne risultano per facilitare l'analisi chimica ad alto rendimento e l'imaging NMR di colture cellulari con risoluzione di una singola cellula. Le limitazioni del presente dispositivo includono i tempi medi sostanziali richiesti a concentrazioni fisiologiche che vanno dal volume micromolare al volume millimolare. I ricercatori propongono di utilizzare campi magnetici più elevati con sequenze di impulsi a microonde XY8-N più lunghe e sensibili per migliorare la sensibilità NMR e l'efficienza della raccolta di fotoni in contrasto con i metodi esistenti. A lungo termine, si aspettano che i maggiori guadagni di sensibilità avvengano tramite metodi di iperpolarizzazione ottica non invasiva.
RMN COZY 2D di DFB. (A) Sequenza di impulsi COZY omonucleare, (B) spettro simulato, e (C) spettro NV NMR sperimentale di DFB. (D) Una sequenza COSY eteronucleare modificata rivela picchi fuori diagonale sia nella simulazione (E) che nell'esperimento (F). Le scale di colore corrispondono al valore assoluto normalizzato della trasformata di Fourier 2D. Gli assi verticali (f1 − fref) corrispondono alle frequenze della dimensione t1, e gli assi orizzontali (f2 − fref) corrispondono alle frequenze della dimensione t2. In (C), Sono stati utilizzati 14 valori di t1 con incrementi di 0,021 s fino a 0,294 s. Il tempo totale di acquisizione è stato di 22 ore. In (F), Sono stati utilizzati 16 valori di t1 con incrementi di 0,021 s fino a 0,336 s. Il tempo totale di acquisizione è stato di 25 ore. In entrambi i casi, l'acquisizione di t2 è durata da 0 a 1,25 s. Tutte le simulazioni sono state eseguite utilizzando il pacchetto SPINACH. I dati di simulazione e sperimentali utilizzano le stesse funzioni di finestratura. Credito:progressi scientifici, doi:10.1126/sciadv.aaw7895.
L'uso di bassa intensità di campo esterno (B 0 ) di 13 mT era un'altra limitazione dello studio poiché limitava la capacità di risolvere la scissione spettrale dovuta a spostamenti chimici. Il team mira a migliorare la risoluzione dello spostamento chimico aumentando B 0 a ~ 0,25 T, utilizzando il presente schema di rilevamento. Inoltre, sebbene il sensore microfluidico NMR avesse un volume di rilevamento effettivo di ~ 40 pL, gli scienziati hanno richiesto diversi millilitri di analita per riempire il flusso complessivo dell'apparato. I futuri chip microfluidici possono quindi miniaturizzare o omettere i passaggi di pre-polarizzazione o utilizzare canali microfluidici più piccoli per il rilevamento in un sistema fluidico più grande.
In questo modo, Janis Smits e collaboratori hanno dimostrato l'uso di sensori quantistici in diamante per applicazioni NMR microfluidica. Hanno dimostrato che la separazione delle fasi di polarizzazione e rilevamento ha consentito un miglioramento dell'ordine di grandezza della risoluzione spettrale rispetto agli studi NMR del diamante esistenti. Gli scienziati hanno convalidato la piattaforma eseguendo l'NMR 2-D sugli analiti dei fluidi e ne propongono le future applicazioni in campi di ricerca multidisciplinari.
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