Da decenni gli scienziati utilizzano la microscopia a fluorescenza per studiare il funzionamento interno delle cellule e degli organismi biologici. Però, molte di queste piattaforme sono spesso troppo lente per seguire l'azione biologica in 3-D; e troppo dannoso per gli esemplari biologici viventi con forte illuminazione luminosa.

Per affrontare queste sfide, un gruppo di ricerca guidato dal Dr. Kevin Tsia, Professore Associato del Dipartimento di Ingegneria Elettrica ed Elettronica e Direttore del Corso di Laurea in Ingegneria in Ingegneria Biomedica dell'Università di Hong Kong (HKU), ha sviluppato una nuova tecnologia di imaging ottico, la microscopia a matrice di fogli di luce codificata (CLAM), che può eseguire l'imaging 3D ad alta velocità, ed è efficiente dal punto di vista energetico e sufficientemente delicato da preservare i campioni viventi durante la scansione a un livello non raggiunto dalle tecnologie esistenti.

Questa tecnologia di imaging avanzata è stata recentemente pubblicata in Luce:scienza e applicazioni . Per l'innovazione è stata depositata una domanda di brevetto statunitense.

"CLAM consente l'imaging a fluorescenza 3-D ad un frame rate elevato paragonabile alla tecnologia all'avanguardia (~10 volumi al secondo). Ancora più importante, è molto più efficiente dal punto di vista energetico, essere più di 1, 000 volte più delicato dei microscopi 3D standard ampiamente utilizzati nei laboratori scientifici, che riduce notevolmente il danno arrecato agli esemplari vivi durante la scansione, " ha spiegato il dottor Tsia.

Le piattaforme di microscopia biologica 3D esistenti sono lente perché l'intero volume del campione deve essere scansionato in sequenza e ripreso punto per punto, riga per riga o piano per piano. In queste piattaforme, una singola istantanea 3D richiede un'illuminazione ripetuta sul campione. Gli esemplari sono spesso illuminati con migliaia o milioni di volte più intensità di quella della luce solare. È probabile che questo danneggi il campione stesso, quindi non è favorevole per l'imaging biologico a lungo termine per diverse applicazioni come la scienza anatomica, biologia dello sviluppo e neuroscienze.

Inoltre, queste piattaforme spesso esauriscono rapidamente il limitato "budget" della fluorescenza, un vincolo fondamentale che la luce fluorescente può essere generata solo su illuminazione per un periodo limitato prima che svanisca permanentemente in un processo chiamato "foto-sbiancamento, " che stabilisce un limite al numero di acquisizioni di immagini che possono essere eseguite su un campione.

"L'illuminazione ripetuta sul campione non solo accelera il foto-sbiancamento, ma genera anche un'eccessiva luce di fluorescenza che alla fine non forma l'immagine finale. Quindi, il "budget" della fluorescenza è in gran parte sprecato in queste piattaforme di imaging, " ha aggiunto la dottoressa Tsia.

Il cuore di CLAM è trasformare un singolo raggio laser in un array ad alta densità di 'fogli di luce' con l'uso di una coppia di specchi paralleli, diffondersi su un'ampia area del campione come eccitazione della fluorescenza.

"L'immagine all'interno dell'intero volume 3-D viene catturata simultaneamente (cioè parallelizzata), senza la necessità di scansionare il campione punto per punto o linea per linea o piano per piano come richiesto da altre tecniche. Tale parallelizzazione 3-D in CLAM porta a un'imaging a fluorescenza 3-D molto delicata ed efficiente senza sacrificare la sensibilità e la velocità, " come sottolineato dal Dr. Yuxuan Ren, un ricercatore post-dottorato sul lavoro. CLAM supera anche i comuni metodi di imaging a fluorescenza 3-D nel ridurre l'effetto del foto-sbiancamento.

Per preservare la risoluzione e la qualità dell'immagine in CLAM, il team si è rivolto al Code Division Multiplexing (CDM), una tecnica di codifica di immagini ampiamente utilizzata nelle telecomunicazioni per inviare più segnali contemporaneamente.

"Questa tecnica di codifica ci consente di utilizzare un sensore di immagine 2D per acquisire e ricostruire digitalmente tutti gli stack di immagini in 3D contemporaneamente. Il CDM non è mai stato utilizzato prima nell'imaging 3D. Abbiamo adottato la tecnologia, che è diventato un successo, "spiegato dalla dottoressa Queenie Lai, un altro ricercatore postdottorato che ha sviluppato il sistema.

Come dimostrazione di prova del concetto, il team ha applicato CLAM per acquisire video 3D del flusso rapido di microparticelle in un chip microfluidico a una velocità di oltre 10 volumi al secondo paragonabile alla tecnologia all'avanguardia.

"CLAM non ha limiti fondamentali nella velocità di imaging. L'unico vincolo è dalla velocità del rivelatore impiegato nel sistema, ovvero la fotocamera per scattare istantanee. Poiché la tecnologia delle fotocamere ad alta velocità avanza continuamente, CLAM può sempre sfidare il suo limite per raggiungere una velocità di scansione ancora maggiore, " evidenziato dal Dr. Jianglai Wu, la ricerca post-dottorato che ha avviato il lavoro.

Il team ha compiuto un ulteriore passo avanti per combinare CLAM con la tecnologia di pulizia dei tessuti di recente sviluppo della Facoltà di Medicina HKU LKS per eseguire la visualizzazione 3D dei glomeruli di topo e della vascolarizzazione del sangue intestinale con un frame rate elevato.

"Prevediamo che questa tecnica combinata possa essere estesa a indagini istopatologiche 3D su larga scala di campioni biologici d'archivio, come mappare l'organizzazione cellulare nel cervello per la ricerca neuroscientifica." Ha detto il dott. Tsia.

"Poiché l'imaging CLAM è significativamente più delicato di tutti gli altri metodi, favorisce unicamente la 'sorveglianza' a lungo termine e continua degli esemplari biologici nella loro forma vivente. Questo potrebbe potenzialmente avere un impatto sulla nostra comprensione fondamentale in molti aspetti della biologia cellulare, per esempio. monitorare continuamente come un embrione animale si sviluppa nella sua forma adulta; monitorare in tempo reale come le cellule/organismi vengono infettati da batteri o virus; per vedere come le cellule cancerose vengono uccise dai farmaci, e altri compiti impegnativi irraggiungibili oggi dalle tecnologie esistenti, " ha aggiunto la dottoressa Tsia.

CLAM può essere adattato a molti sistemi di microscopi attuali con modifiche hardware o software minime. Approfittando di questo, il team sta pianificando di aggiornare ulteriormente l'attuale sistema CLAM per la ricerca in biologia cellulare, biologia dello sviluppo animale e vegetale.