Il mondo della microscopia a scansione laser è in rapida evoluzione, grazie all'avvento di array di rilevatori veloci e compatti. Questi array sostituiscono il tipico rilevatore a elemento singolo dei tradizionali microscopi confocali a scansione laser, consentendo funzionalità nuove e uniche.
Mentre i rilevatori convenzionali forniscono solo il valore di intensità della luce raccolta, un rilevatore pixelato consente anche di registrare la distribuzione spaziale della luce incidente, costruendo di fatto una piccola immagine dell'area illuminata per ciascun punto di scansione.
Le informazioni spaziali aggiuntive fornite dagli array di rilevatori consentono una tecnica di super risoluzione nota come microscopia a scansione di immagini (ISM). ISM costruisce computazionalmente una singola immagine da un set di dati multidimensionali grezzi prodotto da un microscopio. L'immagine finale è costruita con un rapporto segnale-rumore (SNR), un sezionamento ottico e una risoluzione spaziale migliori rispetto a quelli di un microscopio confocale tradizionale.
Nel dettaglio, la risoluzione laterale dell'immagine ISM può superare il limite di Abbe fino a un fattore due. Questi vantaggi, però, si ottengono sfruttando solo le informazioni spaziali; il moderno bioimaging a fluorescenza può essere ulteriormente arricchito dall'acquisizione risolta nel tempo, che consente l'accesso alle informazioni strutturali e funzionali codificate nella dinamica della fluorescenza (ad esempio, durata della fluorescenza).
Recentemente, i ricercatori dell’Istituto Italiano di Tecnologia (IIT) di Genova hanno sviluppato un microscopio ISM compatto ed efficace dotato di un rilevatore a matrice di diodi a valanga a singolo fotone (SPAD) in grado di fornire immagini strutturali e funzionali ad alta risoluzione in un’unica architettura. La ricerca è pubblicata su Advanced Photonics .
Il rilevatore a matrice SPAD segnalato comprende 25 diodi indipendenti disposti in una griglia quadrata. Le dimensioni ridotte e la lettura asincrona consentono il rilevamento rapido dei fotoni di fluorescenza che interferiscono. Lo schema di acquisizione dati, basato sul metodo del dominio della frequenza digitale (DFD), è una tecnica di campionamento eterodina che consente la costruzione dell'istogramma di decadimento della fluorescenza con una risoluzione temporale fino a 400 ps, adatta per la maggior parte delle applicazioni di imaging in fluorescenza.
La tecnica è abbastanza semplice da consentire il calcolo dell'istogramma sulla stessa scheda FPGA (field-programmable-gate-array) utilizzata per controllare il microscopio e registrare il segnale rilevato, semplificando l'architettura del microscopio.
Grazie alle informazioni spaziali e temporali uniche fornite dal rilevatore ad array SPAD, gli autori hanno dimostrato la combinazione delle misurazioni della durata della fluorescenza (FL) con ISM (FLISM). Oltre ai vantaggi dell'ISM convenzionale, il migliore SNR delle immagini FLISM consente una stima più affidabile della durata della fluorescenza.
Il rapporto mette in luce la versatilità del microscopio combinando le misurazioni ISM e risolte nel tempo con la microscopia a deplezione delle emissioni stimolate (STED), utilizzando la tecnica SPLIT (Separation by Life Tuning). Il risultato è un'immagine con risoluzione laterale e contrasto migliorati ottenuti senza modificare lo schema di acquisizione. Inoltre, le misurazioni risolte nel tempo consentono l'imaging multispecie con un singolo rilevatore per una maggiore specificità strutturale.
Il sistema è in grado di distinguere diversi coloranti con i loro valori di vita della fluorescenza, grazie alla rappresentazione fasore della dinamica della fluorescenza. Anche utilizzando coloranti con valori di durata simili e spettri di eccitazione sovrapposti, è possibile distinguere i diversi fluorofori utilizzando la tecnica di eccitazione a interleaving pulsato.
Infatti, alternando impulsi di eccitazione del laser con colori diversi, l'informazione spettrale viene effettivamente codificata nella dimensione temporale. Grazie all'eccellente risoluzione temporale del microscopio proposto, il contributo dei due coloranti fluorescenti può essere successivamente separato per evitare la diafonia.
Secondo Giuseppe Vicidomini, ricercatore principale presso il laboratorio di microscopia e spettroscopia molecolare dell'IIT e autore corrispondente, "I risultati di questo lavoro suggeriscono che il futuro della microscopia a scansione laser è strettamente connesso ai rivelatori ad array SPAD, in grado di arricchire il set di dati della microscopia con ulteriori informazioni spaziali e temporali senza la necessità di modificare l'architettura ottica di un microscopio confocale."
Il lavoro dimostra che i rilevatori di array SPAD combinati con un sistema di acquisizione su misura rendono l'ISM risolto con fotoni facilmente accessibile e utilizzabile.
Ulteriori informazioni: Giorgio Tortarolo et al, Microscopio a scansione di immagini con risoluzione fotonica compatto ed efficace, Fotonica avanzata (2024). DOI:10.1117/1.AP.6.1.016003
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