Alle 2 di notte di una notte dello scorso aprile, Michael Schoof ha controllato tre volte i numeri sul suo schermo, fece un respiro profondo, e ha lanciato un'e-mail che stava aspettando di inviare tutto il giorno.

"Penso che stia funzionando" era la cauta formulazione del suo messaggio.

Schoof, uno studente laureato nel laboratorio di Peter Walter, dottorato di ricerca, un rinomato scienziato specializzato nella selezione delle proteine ​​e nelle membrane cellulari, faceva parte di una piccola squadra in una missione donchisciottesca:immobilizzare SARS-CoV-2, il nuovo coronavirus che causa il COVID, utilizzando una versione sintetica di minuscoli anticorpi originariamente scoperti nei lama e nei cammelli. Questi "nanocorpi, "come sono conosciuti, proveniva dal laboratorio di Aashish Manglik dell'Università di San Francisco, M.D., dottorato di ricerca, un emergente scienziato proteico che aveva trascorso i tre anni precedenti a costruire una vasta libreria di nanocorpi e a sviluppare nuovi modi per sfruttare le loro proprietà insolite.

Durante il mese precedente, Schoof aveva trascorso la maggior parte delle sue ore di veglia rinchiuso nel complesso di laboratori altrimenti vuoto nel campus di Mission Bay della UCSF. Era l'apice dell'impennata della primavera 2020 di COVID, e solo il personale sanitario essenziale e coloro che lavorano sulla scienza relativa alla pandemia sono stati ammessi nelle strutture dell'Università. Schoof aveva costretto il suo compagno di stanza, un compagno di studi di nome Reuben Saunders, a lavorare con lui al progetto. Cibandosi di gnocchi al vapore e litri di tè, stavano smistando i 2 miliardi di nanocorpi nella biblioteca di Manglik nella speranza di identificare una molecola in grado di avvicinarsi al micidiale SARS-CoV-2 e immobilizzarlo. Ora, finalmente, Schoof era convinto di aver raggiunto la prima grande svolta.

Il primo passo in qualsiasi infezione virale è un dirottamento cellulare. Per ottenere il controllo di una cellula umana, SARS-CoV-2 aggancia i picchi simili a un rampino sul proprio esterno a proteine ​​chiamate recettori ACE2 all'esterno di una cellula bersaglio. Ma cosa succede se, i ricercatori si sono chiesti, potevano bloccare il dirottatore dando ai rampini qualcos'altro a cui aggrapparsi?

Quel giorno, Schoof aveva iniziato a eseguire test su centinaia di colonie di lievito, ciascuno progettato per produrre determinati nanocorpi dalla biblioteca di Manglik. Tutti questi particolari nanocorpi avevano dimostrato la capacità di agganciarsi ai picchi di SARS-CoV-2. Ora era il momento di porre le domande chiave:quanto erano strettamente legati questi nanocorpi alle punte? Erano in grado di competere con i recettori ACE2?

Per scoprirlo, Schoof aveva mescolato le sue cellule di lievito che esprimono nanobody con picchi di SARS-CoV-2 fluorescenti. Quando guardò i risultati delle prime due tavole, sentì un impeto di eccitazione, che ha rapidamente temperato con lo scetticismo scientifico che gli era stato insegnato a coltivare. Alcuni dei nanocorpi si attaccavano ai picchi di SARS-CoV-2, ma potevano ancora essere messi da parte da un eccesso di recettori ACE2 umani:chiara prova di un potenziale neutralizzatore.

"Quella, "ricorda, "è quando abbiamo capito di avere qualcosa."

Nei giorni che seguirono la circospetta e-mail a tarda notte di Schoof, Walter e Manglik hanno sfruttato le rispettive reti di contatti scientifici, chiamando rinforzi dai laboratori in tutto il campus e fino a Parigi per aiutare nella fase successiva della loro ricerca. Prossimamente, la piccola squadra si era trasformata in un vero e proprio esercito di ricercatori interdisciplinari e studenti laureati. A novembre, hanno pubblicato i loro risultati sulla prestigiosa rivista Science. Nella carta, quasi 60 coautori hanno descritto un audace, contromisura innovativa per il COVID, proponendo che i loro nanocorpi potrebbero essere utilizzati in modo poco costoso, spray nasale facile da trasportare in grado di neutralizzare SARS-CoV-2. Tra loro, hanno soprannominato le molecole AeroNabs.

Da allora, il team UCSF ha cercato un partner industriale disposto a finanziare il costoso e rigoroso processo di sperimentazione clinica, ma attualmente le aziende farmaceutiche sono focalizzate sullo sviluppo di vaccini per la prevenzione e sugli anticorpi più tradizionali per il trattamento.

Ma l'approccio nanobody è promettente. A causa della semplice struttura dei nanocorpi, AeroNabs potrebbe essere molto più economico e veloce da produrre in serie, molto più facile da trasportare, e molto più facile da conservare rispetto ai tradizionali anticorpi attualmente in uso e in fase di sviluppo.

"Questo è qualcosa che potresti prendere dopo essere risultato positivo che potrebbe ridurre immediatamente la tua carica virale, " Dice Walter. "Quindi le tue possibilità di sviluppare una malattia grave sarebbero ridotte da questo trattamento".

Nota anche che la vaccinazione di massa richiederà tempo, e che non tutti nella popolazione possono o saranno vaccinati, rendendo la protezione passiva ancora incredibilmente preziosa. "E, " Aggiunge, "non sappiamo fino a che punto il vaccino sarà disponibile al di fuori dei paesi più ricchi del mondo".

Duo dinamico

I semi del progetto AeroNabs sono stati piantati nel 2017, quando Walter ha sentito Manglik tenere un discorso sul suo lavoro.

A prima vista, i due scienziati sembrano essere una strana coppia. Con la sua testa piena di capelli scuri, sorriso da ragazzo, e il mento ben rasato, Manglik potrebbe essere scambiato per uno studente laureato. Infatti, è una stella nascente nel suo campo che nel 2013 ha fatto Scientifico americano la lista dei "30 sotto i 30". Nato in India, Manglik ha trascorso i suoi primi otto anni in Arabia Saudita prima che la sua famiglia emigrasse a Des Moines, Iowa, dove ha scoperto la scienza al college. Il sessantenne Walter, d'altra parte, sfoggia una folta barba e baffi bianchi e occhiali con lenti piccole. È nato e cresciuto in Germania, è venuto negli Stati Uniti per il suo lavoro di laurea, e ha tracciato una carriera leggendaria. I suoi numerosi riconoscimenti includono il prestigioso Lasker Award, spesso visto come un precursore di un premio Nobel. Ma nonostante le loro differenze, Walter e Manglik condividono una profonda passione per la biologia molecolare e per i suoi elementi costitutivi organici infinitamente flessibili:le proteine.

Il discorso di Manglik quel giorno riguardava il suo sforzo di assemblare una delle più grandi biblioteche di nanocorpi al mondo, un promettente, un tipo relativamente nuovo di anticorpo derivato dal sangue dei lama, cammelli, e altri animali della famiglia dei camelidi. Aveva imparato a conoscere i nanocorpi alla scuola di specializzazione a Stanford, dopo essersi innamorato dello studio dei recettori, un'ampia famiglia di proteine ​​coinvolte nella segnalazione intercellulare. I recettori sporgono dalle cellule come antenne, ognuno risponde ad uno specifico segnale chimico. Mentre studiavo i recettori umani dell'adrenalina, Manglik ha fatto ampio uso di nanocorpi, quale, grazie alle loro piccole dimensioni, può interagire con i recettori con molta più precisione rispetto agli anticorpi su misura che stava usando per esplorare le proprietà dei recettori. I suoi esperimenti hanno rivelato come le diverse configurazioni geometriche dei recettori influenzino il loro comportamento di segnalazione.

"Le proteine ​​non sono solo semplici Lego che si incastrano tra loro:sono come Lego fatti di gelatina o mastice, " Manglik spiega. "Sono in continuo movimento. Infatti, è il movimento di una proteina, si scopre, che conta davvero per come funziona. E i nanocorpi possono aiutarci a controllare quel movimento".

Nanobodies:un vantaggio per la scienza

I nanobodies sono stati scoperti alla fine degli anni '80 da una coppia di studenti universitari presso la Libera Università di Bruxelles, dopo che si erano avvicinati notoriamente al loro professore di biologia, un immunologo di nome Raymond Hamers, lamentarsi di un incarico. La storia ha oscurato il motivo della loro denuncia; un resoconto ampiamente citato sostiene che gli studenti erano preoccupati che il compito, che ha richiesto loro di analizzare gli anticorpi nel sangue umano, potrebbe infettarli con una malattia. Un'altra versione narra che gli studenti abbiano ritenuto l'esperimento noioso e abbiano chiesto al loro professore di assegnare loro qualcosa di più originale.

Qualunque sia la verità, nessuno mette in dubbio quello che è successo dopo. Rovistando in un frigorifero da laboratorio, Hamers ha trovato una fiala di siero di cammello dromedario congelato infettato da parassiti che si ritiene causino la malattia del sonno africana. Lo diede agli studenti e suggerì di isolare gli anticorpi nel sangue di cammello per vedere che aspetto avevano. Quando gli studenti purificarono il sangue, hanno scoperto qualcosa di straordinario.

Oltre agli anticorpi standard presenti in tutti i vertebrati, i campioni purificati contenevano un anticorpo derivato mai visto prima nella scienza:più piccolo, proteine ​​più semplici, che gli studenti all'inizio scambiarono per frammenti di anticorpi convenzionali. Ulteriori esami hanno rivelato che si trattava di una classe completamente nuova di agenti immunitari, privo di una delle catene proteiche presenti in tutti gli altri anticorpi precedentemente studiati.

La scoperta ha portato a un rivoluzionario articolo del 1993 sulla prestigiosa rivista Natura . Hamers e i suoi studenti hanno soprannominato i nuovi minuscoli nanocorpi proteici. Anticorpi simili a catena singola sono stati successivamente identificati nei lama, alpaca, guanachi (un altro mammifero sudamericano dal collo lungo), e persino squali.

Divenne presto evidente non solo che i nanocorpi erano utili immunologicamente, ma che le loro piccole dimensioni li rendevano utili strumenti sperimentali, come Manglik e i suoi colleghi dell'UCSF possono ampiamente confermare.

Studiando come si muovono questi mattoni gelatinosi a livello molecolare, scatta e sgancia, e interagire sono diventati l'obiettivo di Manglik quando è entrato a far parte della facoltà della UCSF. Sapeva fin dall'inizio che i nanocorpi sarebbero stati una parte importante del suo lavoro. Sebbene esistano anticorpi e nanocorpi per aiutare gli animali a combattere le infezioni, Manglik li vede anche come uno strumento infinitamente malleabile che può essere utilizzato per hackerare una vasta gamma di processi nel corpo umano e per decodificare misteri scientifici di base. Ma i nanocorpi richiedevano molto tempo per essere realizzati e richiedevano l'accesso ai camelidi. Come studente laureato, Manglik si era affidato a un collaboratore in Belgio che avrebbe iniettato una proteina recettore di interesse in un lama, quindi raccogli i nanocorpi dal sangue dell'animale. L'intero processo ha richiesto mesi di lavoro molto specializzato, cosa che solo pochi gruppi avevano la capacità di fare.

Per democratizzare l'accesso ai nanocorpi per i ricercatori di tutto il mondo, Manglik ha collaborato con Andrew Kruse, dottorato di ricerca, un caro amico della scuola di specializzazione che si era unito alla facoltà della Harvard Medical School. Insieme, i due laboratori hanno creato trilioni di sequenze di DNA codificanti nanobody uniche, ciascuno ispirato ai nanocorpi che normalmente si trovano all'interno dei lama. Le sequenze di DNA per questi nanocorpi sono ospitate in un vasto pool di miliardi di minuscole cellule di lievito, ognuno dei quali può essere persuaso a mettere una copia di un singolo nanobody sulla sua superficie. Bypassando completamente la necessità di un lama vivente, tale libreria offre ai ricercatori l'accesso alle cellule di lievito che ospitano nanocorpi specifici per qualsiasi compito. Manglik e Kruse hanno condiviso apertamente le loro biblioteche con centinaia di laboratori in tutto il mondo.

"L'idea è che in un animale, ci sono trilioni di nanocorpi diversi per combattere contro tutto ciò che può incontrare, " dice. "Volevamo creare una libreria che codificasse miliardi di singoli nanocorpi. Questa libreria sarebbe un ottimo punto di partenza per trovare un nanobody contro praticamente qualsiasi cosa, tutto in laboratorio e senza la necessità di iniettare un animale".

Dopo aver sentito Manglik spiegare tutto questo, Walter ha guidato il suo studente laureato Michael Schoof nel laboratorio di Manglik. Schoof stava cercando di modulare il comportamento di una proteina correlata alla lesione cerebrale traumatica, e Walter sospettava che i nanocorpi di Manglik potessero essere utili in quello sforzo.

Poi è arrivato il coronavirus, il mondo si è fermato, e quasi tutte le attività non legate al COVID presso l'Università sono state chiuse.

"Quindi a quel punto, Noi abbiamo detto, "Bene, possiamo sederci a casa adesso, o possiamo pensare come possiamo davvero aiutare in questa spinta per una soluzione, '", ricorda Walter.

Entro pochi giorni, Walter e Schoof erano in contatto e-mail con Manglik. Conoscevano le proprietà di lotta contro le malattie dei nanocorpi. Una tecnologia nanobody aveva recentemente ottenuto l'approvazione della FDA per il trattamento di un disturbo della coagulazione del sangue, e un altro, usato per trattare un virus respiratorio, aveva raggiunto studi clinici in fase avanzata.

Era possibile costruirne uno per combattere il coronavirus?

Un risultato sorprendente

Dall'inizio, la squadra sapeva, il successo del progetto si baserebbe sulla loro capacità di trovare un nanocorpo con sufficiente affinità di legame, la capacità di attaccarsi e legarsi ai picchi del coronavirus.

Le proteine ​​hanno forme specifiche. Il modo in cui due proteine ​​si adattano insieme determina la loro affinità di legame. Walter e Manglik sapevano che l'affinità di legame che fa aderire SARS-CoV-2 alle proteine ​​ACE2 potrebbe teoricamente essere sopraffatta da un nanocorpo modellato nel modo giusto.

Manglik aveva già un ingrediente chiave per un simile esperimento. I ricercatori dell'Università del Texas (UT) di Austin hanno recentemente rivelato la struttura unica dei picchi di SARS-CoV-2 che ha permesso al virus di legarsi ai recettori ACE2 delle cellule umane. Manglik ha contattato Jason McLellan di UT, dottorato di ricerca, che accettò di inviargli il loro "costrutto" - un pezzo di DNA che codifica per le punte che potrebbe essere inserito in un'altra cellula, espresso in grandi quantità, purificato, e utilizzato per esperimenti.

Il team ha iniziato a esaminare i 2 miliardi di nanocorpi nella libreria per vedere se potevano trovare composti con la giusta affinità di legame con i picchi di SARS-CoV-2. Entro tre settimane, avevano identificato 800 potenziali candidati, e una settimana dopo Schoof scrisse la sua cauta e-mail a tarda notte informando Manglik e Walter che aveva visto alcuni primi risultati positivi. A fine aprile, il team aveva identificato 21 nanocorpi distinti che sembravano competere con il recettore ACE2, bloccando teoricamente il meccanismo di attacco SARS-CoV-2.

Fu allora che la piccola squadra iniziò a crescere, reclutando biologi strutturali per concentrarsi su come i nanocorpi si legano alla proteina spike SARS-CoV-2, e quindi utilizzare queste informazioni per progettare modifiche per renderle ancora più potenti.

Ciò ha richiesto la purificazione di 21 proteine ​​candidate, testare il loro legame, e quindi utilizzando le strutture di microscopia crioelettronica dell'UCSF per visualizzare con una risoluzione quasi atomica i candidati più promettenti, mentre erano legati al picco di SARS-CoV-2. Per completare questo compito monumentale, hanno unito le forze con uno sforzo parallelo noto come QCRG Structural Biology Consortium, un processo simile a una catena di montaggio messo insieme da 12 membri della facoltà UCSF e oltre 60 tirocinanti per affrontare SARS-CoV-2. Lo sforzo è stato alimentato da un senso di urgenza, e i partecipanti hanno lavorato ore estenuanti fino a tarda notte.

Una volta che il team ha avuto le immagini dei migliori nanocorpi legati al picco di SARS-CoV-2, hanno iniziato a esaminare il meccanismo di legame unico di ciascun nanobody e hanno utilizzato tali informazioni per progettare una versione di nuova generazione. Hanno deciso di costruire un nanocorpo a tre braccia costituito da tre copie di un singolo nanocorpo cucite insieme in modo che potesse legarsi contemporaneamente ai tre bracci separati che compongono ogni picco di coronavirus.

Dopo aver cucito insieme i nanocorpi e averli testati, Bryan Faust, uno studente laureato nel laboratorio di Manglik, ha fornito la prossima scoperta emozionante:ciascuno dei tre bracci ha migliorato in modo esponenziale il legame dei suoi vicini. La capacità della versione migliorata di legarsi ai picchi virali è aumentata di duecentomila volte.

"Questo è stato un risultato straordinario:vedere questo enorme ordine di miglioramento, "Ricorda Walter. "Era il momento di una celebrazione assoluta".

Per testare il composto contro un virus vivo, il team aveva bisogno di un laboratorio con una designazione di livello di biosicurezza 3 (BSL-3). Il gruppo ha reclutato Marco Vignuzzi, dottorato di ricerca, un ex postdoc UCSF che gestisce un laboratorio BSL-3 presso l'Institut Pasteur di Parigi. entro giugno, uno dei postdoc di Vignuzzi stava eseguendo il nanobody UCSF contro l'attuale SARS-CoV-2 per vedere se era in grado di neutralizzare il virus.

Il risultato finale è stato sia altamente efficace che stabile, così stabile che può essere consegnato in forma di aerosol utilizzando un nebulizzatore a rete che Manglik ha acquistato su Amazon.

Con il laser di Big Pharma focalizzato sullo sviluppo di vaccini e anticorpi tradizionali, trovare un percorso rapido per la commercializzazione si è rivelato difficile. Ma Manglik, Walter, e la loro squadra sono imperterriti.

"È quasi certo che ci saranno più pandemie respiratorie nella nostra vita, " dice Manglik. "Potrebbe essere l'influenza, un'altra pandemia di SARS, o qualche agente patogeno che non conosciamo ancora. Per la prossima pandemia, la speranza è che i ricercatori possano andare non solo veloci come abbiamo fatto noi, ma forse anche più velocemente."

Senza dubbio, sarebbe difficile trovare una testimonianza più potente della deliziosa imprevedibilità e del potenziale della scienza moderna, che una pandemia che ha causato la solitudine, sofferenza, e la morte ha anche dato origine a questo eclettico equipaggio e alla loro soluzione potenzialmente salvavita che solo pochi anni fa poteva sembrare assurda.

"È solo una di quelle cose in cui dici, "Vogliamo andare in questa avventura, '" dice Walter. "Ci siamo impegnati, e poi ha funzionato molto meglio di quanto avremmo potuto sognare."