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    Come analizzare l'elettroforesi

    Nell'elettroforesi su gel, i campioni di DNA o di proteine ​​vengono separati - in genere in base alle dimensioni - applicando un campo elettrico che li fa migrare attraverso un gel. L'uso dell'elettroforesi su gel è di routine nei laboratori di ricerca biomedica ed è utilizzato per rispondere a una varietà di domande diverse, quindi non esiste un modo veramente universale per analizzare i risultati. Diverse tecniche come Western blotting, Northern blotting e Southern blotting, ad esempio, riguardano tutte l'elettroforesi su gel. Se stai facendo l'elettroforesi su gel di agarosio di campioni di DNA, il tipo più comune di procedura, di solito devi fare almeno due cose: 1) distinguere i plasmidi non tagliati dagli inserti, plasmidi e plasmidi tagliati e 2) stimare le dimensioni dei vari frammenti di DNA. Ecco come funziona.

    Controlla il tuo quaderno di laboratorio per determinare quali campioni sono stati caricati in quali corsie. Quando hai caricato i pozzetti per il tuo gel, dovresti aver notato l'identità di ogni corsia /campione.

    Determina quale corsia contiene la "scala" degli standard del DNA. Questi sono frammenti di lunghezza nota; la distanza di migrazione può essere utilizzata per determinare la dimensione dei frammenti del campione.

    Utilizzando un righello, misurare la distanza della foto dai pozzetti al colorante di tracciamento, che avrà viaggiato più lontano rispetto a qualsiasi delle bande di DNA (in altre parole, sarà nella parte inferiore del gel). Registra questo numero - le unità che usi non sono importanti.

    Misura la distanza della tua immagine dai pozzi a ciascuna delle bande nella "scala", quindi dividi quella distanza per la distanza percorsa dal tracciamento della banda colorante. Questo calcolo ti dà la relativa mobilità di ciascuna banda.

    Esempio: Supponiamo che la banda di colorazione di tracciamento abbia percorso 6 pollici e che abbiamo tre bande che hanno viaggiato 5, 4,5 e 3,5 pollici. Qual è la loro mobilità relativa? Risposta: dividiamo 5, 4,5 e 3,5 per 6 per ottenere le relative mobilità di 0,833, 0,75 e 0,5833.

    Inserisci le relative mobilità nel tuo foglio di calcolo (Excel o qualsiasi altro programma simile che usi) insieme al dimensione in kilobasi di ciascun frammento nella scala. (Il produttore ti dà la dimensione di ogni frammento nelle scale che forniscono, quindi dovresti già avere queste informazioni.)

    Rappresenta graficamente i dati con relativa mobilità su xe dimensioni in kilobasi su y.

    Utilizzare la funzione Trendline del programma per fogli di calcolo per adattare un'equazione ai dati. Questa equazione dovrebbe essere un'equazione di potenza (per esempio x ^ -2) e dovrebbe adattarsi ai dati relativamente bene (coefficiente R di almeno 0.9).

    Guarda le bande corrispondenti ai tuoi campioni. Ricorda che i frammenti di DNA più piccoli viaggiano più attraverso il gel rispetto a grandi frammenti di DNA, quindi quelli più vicini al colorante di tracciamento saranno i più piccoli. Si noti, tuttavia, che se il DNA plasmidico (circolare) non è tagliato, diventerà "supercoiled" o attorcigliato come un cavo telefonico, che in realtà lo farà viaggiare più FARDAMENTE del DNA lineare della stessa dimensione. Allo stesso modo, un plasmide "nicked" che è stato tagliato in modo incompleto percorrerà una distanza più breve rispetto al DNA lineare della stessa dimensione. Di conseguenza, non puoi stimare la dimensione dei plasmidi non tagliati dal tuo gel.

    Abbina le fasce in ogni corsia con l'identità del campione che hai caricato in quella corsia e determina se ciò che vedi è ciò che ti aspetteresti . Ciò dipenderà dalla natura del tuo esperimento. In generale, tuttavia, se si digerisce un plasmide di inserto con due enzimi di restrizione, ci si aspetterebbe che l'inserto venga liberato dal plasmide; poiché è molto più piccolo del plasmide, ti aspetteresti di vedere due bande in quella corsia, una vicino alla cima e l'altra in basso vicino al fondo. Un plasmide tagliato con un solo enzima di restrizione dovrebbe formare solo una singola banda che viaggia un po 'più lontano del taglio plasmidico con due enzimi di restrizione, ma da nessuna parte fino all'inserimento.

    Misurare la distanza dai pozzetti a il plasmide tagliato e inserire le fasce con il righello. Dividere questi numeri per la distanza percorsa dal colorante di tracciamento per trovare la mobilità relativa degli inserti e tagliare i plasmidi.

    Collegare la mobilità relativa degli inserti e tagliare i plasmidi nell'equazione calcolata per te dal programma di calcolo. Questo calcolo dovrebbe darti una stima della dimensione di questi plasmidi.

    Suggerimento

    Se vedi strisce luminose e larghe nella parte inferiore di ogni singola corsia, probabilmente hai dell'RNA nel tuo gel - il tuo protocollo di purificazione potrebbe essere difettoso.

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