La diagnostica molecolare gioca un ruolo sempre più importante in medicina per l'individuazione di malattie genetiche, il monitoraggio dell'efficacia della terapia antitumorale, e nella lotta contro le infezioni batteriche aggressive. Diagnostica curiosità (CD), una società appartenente al gruppo Scope Fluidics, ha sviluppato una nuova tecnica per l'analisi del DNA:la PCR sinergica (sPCR). Il metodo, descritto in dettaglio nella pubblicazione congiunta dei ricercatori CD e IPC PAS in Rapporti scientifici combina i vantaggi di due delle tecniche di analisi del codice genetico più diffuse oggigiorno e può essere eseguita su strumenti ampiamente disponibili.

"La tecnica di analisi del DNA che proponiamo è nata durante lo sviluppo dell'innovativo strumento analitico PCR|ONE, che può essere utilizzato per testare il codice genetico in soli sette minuti. Questo è un tempo più che dieci volte più breve di quello richiesto nelle soluzioni classiche, " afferma il Prof. Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

I campioni inviati per le analisi del DNA di solito contengono così poco materiale genetico che la loro analisi con tecniche di laboratorio convenzionali non sarebbe possibile. Dopo aver eliminato le impurità dal campione, il primo passo è aumentare la quantità di materiale genetico, spesso fino a un miliardo di volte. A tale scopo viene utilizzata la reazione a catena della polimerasi (PCR).

La reazione PCR prevede il riscaldamento e il raffreddamento ciclici di una soluzione contenente il materiale genetico in fase di amplificazione e gli opportuni reagenti:una polimerasi (ovvero l'enzima che catalizza la reazione di sintesi del DNA), i nucleotidi necessari per costruire il filamento di DNA, e primer, cioè., brevi frammenti di DNA in grado di attaccarsi all'inizio e alla fine del frammento di codice propagato (ad es. un gene specifico). Ogni ciclo PCR è costituito da fasi di riscaldamento e raffreddamento. Nella prima fase, ad una temperatura di circa 95 gradi centigradi, si rompono i ponti di idrogeno, e la catena di DNA finora a doppio filamento si divide in due singoli filamenti. Nella fase fredda, ad una temperatura di circa 50 gradi, i primer della soluzione si attaccano ai siti corrispondenti sui fili, dopodiché la polimerasi costruisce tra loro un filo complementare. Alla fine di ogni ciclo, ci sono (in condizioni ideali) il doppio dei frammenti di DNA a doppio filamento rispetto all'inizio.

La PCR viene utilizzata per rilevare frammenti specifici del codice genetico e per stimare la quantità originale di materiale genetico. Le misurazioni quantitative vengono solitamente eseguite utilizzando una tecnica analogica nota come PCR in tempo reale. Il campione viene propagato, e nei cicli successivi, la quantità di DNA viene controllata utilizzando coloranti fluorescenti. Quando l'intensità dei cambiamenti supera una soglia impostata, la quantità originale di materiale genetico è stimata in base al numero di cicli. La tecnica della PCR analogica è relativamente semplice, ma a causa della sensibilità della PCR anche a singole particelle di impurità, richiede attenzione, calibrazione continua.

Un altro metodo è la PCR digitale. Il campione è suddiviso in decine o centinaia di migliaia, e talvolta anche milioni di partizioni di uguale volume. Quindi, in ogni partizione, si esegue la procedura di duplicazione del materiale genetico e si verifica se si verifica la modifica del set. Durante la divisione del DNA del campione, le molecole raggiungono solo alcune partizioni, quindi il cambiamento non avviene ovunque. La quantità originale di DNA può quindi essere stimata in base al numero di segnali registrati. Il vantaggio della tecnologia digitale è che non è necessario calibrare il dispositivo. Però, a causa della necessità di condurre un gran numero di reazioni in parallelo, l'apparecchiatura di prova è costosa e non è così comune nei laboratori come l'apparecchiatura PCR analogica.

PCR sinergico, la tecnica proposta da CD e IPC PAS, combina i vantaggi più importanti dei metodi analogico e digitale. Per ottenere misurazioni affidabili, è sufficiente diluire un campione in solo una dozzina, o al massimo diverse decine di partizioni. Questo metodo non richiede calibrazione.

"Un piccolo numero di partizioni, caratteristica della nostra tecnica, ha uno specifico significato pratico. Significa che per eseguire l'analisi, tutto ciò che serve è il formato standard della piastra a pozzetti utilizzato nei comuni dispositivi PCR analogici, "dice Pawel Debski, uno studente di dottorato IPC PAS, che ha sviluppato il metodo sPCR presso Curiosity Diagnostics.

A causa di un piccolo numero di partizioni campione, la tecnica sPCR è più facile da eseguire e leggermente più veloce delle varianti digitali. Rispetto alle tecniche analogiche, però, sono necessari più reagenti. Per questa ragione, non sostituirà la variante analogica, secondo gli scienziati. Però, può essere un'aggiunta preziosa perché non necessita di calibrazione, consentendo così al personale di laboratorio di verificare autonomamente la correttezza delle misurazioni analogiche.

"La nostra tecnica di test del DNA è stata brevettata. Tuttavia, vogliamo sottolineare la libertà di utilizzarlo per scopi non commerciali. E poiché utilizza tipico, popolare attrezzatura per test genetici, tutto ciò che devi fare per iniziare è raggiungere il nostro articolo, " sottolinea il prof. Garstecki.

Nelle macchine PCR standard, una diffusione del calore relativamente lenta tra il campione e un grande blocco adiacente di materiale riscaldato o raffreddato alternativamente viene utilizzata per riscaldare e raffreddare il materiale genetico. In PCR|ONE, la radiazione infrarossa viene utilizzata per riscaldare rapidamente il campione. Anche il meccanismo di raffreddamento a diffusione è stato modificato:il blocco utilizzato a questo scopo è più piccolo rispetto agli strumenti convenzionali e viene mantenuto ad una costante, temperatura rigorosamente controllata. Come risultato dei miglioramenti tecnici e analitici, i prototipi di PCR|ONE sono in grado di completare le analisi del DNA in meno di un quarto d'ora, e la stessa PCR richiede solo sette minuti. I primi dispositivi PCR|ONE arriveranno sul mercato molto probabilmente tra due o tre anni.