Spostati, proteine ​​che modificano i geni:ce n'è una più piccola, più economico, strumento di ingegneria genetica più specifico sul blocco:DNAzymes:piccole molecole di DNA che possono funzionare come enzimi proteici.

I ricercatori dell'Università dell'Illinois Urbana-Champaign hanno sviluppato una tecnica che, per la prima volta, consente a DNAzymes di mirare e tagliare il DNA a doppio filamento, superando un limite significativo della tecnologia. I DNAzymes sono stati utilizzati nel biorilevamento, Calcolo del DNA e molte altre applicazioni. Però, quando si tratta di applicazioni di ingegneria genetica come l'editing genetico o la terapia genica, hanno affrontato una sfida:i DNAzymes sono stati in grado di indirizzare solo siti su DNA a filamento singolo, mentre il DNA che codifica per i geni nelle cellule è a doppio filamento. I ricercatori hanno pubblicato la loro nuova tecnica nel Giornale della Società Chimica Americana .

"DNAzymes ha molti vantaggi, compresa una maggiore stabilità, dimensioni e costi inferiori rispetto agli enzimi proteici. Questi vantaggi si adattano perfettamente al requisito degli strumenti di ingegneria genetica, " ha detto il capo dello studio Yi Lu, un professore di chimica all'Illinois. "Nessun DNAzymes potrebbe alterare il DNA a doppio filamento fino a quando questo non funziona. Facendolo accadere, apriamo la porta a DNAzymes per entrare nell'intero mondo dell'ingegneria genetica."

Nel DNA a doppio filamento, i due filamenti sono specificamente accoppiati tra loro con sequenze complementari. Per consentire a DNAzymes di tagliare il DNA a doppio filamento, il team dell'Illinois ha sviluppato una tecnica che accoppia DNAzymes con molecole ausiliarie chiamate acidi nucleici peptidici.

"Il PNA è un legante del DNA molto forte, abbastanza forte da legarsi a un filamento del DNA a doppio filamento anche se tutte le basi sono già accoppiate con l'altro filamento, " disse Mingkuan Lyu, uno studente laureato e il primo autore del documento. "Una volta che questo processo avviene, un filamento del DNA a doppio filamento sarà occupato da PNA, e l'altro filamento sarà esposto come DNA a filamento singolo, disponibile per l'interazione del DNAzyme."

Il team ha prima dimostrato la tecnica, chiamato nick del DNA a doppio filamento assistito da PNA da DNAzymes, o PANDA, su una sequenza di test sintetica per dimostrare che ha funzionato per tagliare uno o entrambi i filamenti di un bersaglio di DNA a doppio filamento. Hanno anche testato la capacità di PANDA di distinguere una sequenza target specifica da sequenze simili. Questo è importante, i ricercatori hanno detto, poiché l'attività fuori bersaglio non intenzionale è una delle sfide che ha limitato le applicazioni cliniche delle tecniche di editing genetico a base di proteine, come CRISPR.

"In CRISPR-Cas9, la guida RNA è responsabile del riconoscimento del target personalizzato, ma in PANDA, sia il DNAzyme che il PNA lo sono. Perciò, esiste un meccanismo intrinseco di "doppio controllo" in PANDA, rendendolo più rigoroso nella specificità del target, "Lyu ha detto. "Abbiamo testato la specificità mutando solo una base all'interno del bersaglio. Si è scoperto che nella maggior parte dei casi, PANDA può riconoscere questo piccolo cambiamento e rifiutarsi di tagliare il bersaglio sbagliato."

Un altro vantaggio di PANDA è la sua piccola dimensione:il PNA e il DNAzyme insieme sono circa cinque volte più piccoli del complesso CRISPR-Cas9, Lu ha detto, permettendogli di accedere a siti affollati all'interno del DNA strettamente compresso di un cromosoma che una grande proteina non potrebbe raggiungere.

Prossimo, i ricercatori intendono studiare le prestazioni del sistema PANDA che prendono di mira i geni di interesse nelle cellule viventi. Hanno anche in programma di espandere il catalogo di geni che il sistema PANDA può prendere di mira.

"Le sequenze di mira possono essere facilmente modificate e personalizzate per applicazioni specifiche, " Lu ha detto. "Pertanto il sistema PANDA può servire come un nuovo strumento alternativo per una vasta gamma di ingegneria genetica e altre applicazioni biochimiche e biotecnologiche".