La colorazione di Gram è una procedura di colorazione differenziale che mostra quali batteri sono Gram-positivi o Gram-negativi in ​​base al colore della loro colorazione. L'alcol acetonico è un reagente utilizzato in questo processo per fornire la differenziazione del colore. I batteri Gram-positivi hanno uno spesso strato di peptidoglicano e si colorano di viola, mentre i microrganismi Gram-negativi hanno uno strato di peptidoglicano poco o niente e colorano di rosa.

Viola primarie di cristallo di stain

Una volta una diapositiva di viene preparato un campione batterico, il cristal violetto viene utilizzato per colorare prima il campione. A questo punto i batteri Gram-positivi e Gram-negativi appariranno viola. Di solito il cristallo viola viene applicato sul vetrino per 30 secondi prima di lavare via l'eventuale macchia in eccesso con acqua. Il cristallo viola può aderire un po 'agli strati di peptidoglicano, quindi non tutta la macchia primaria verrà lavata via con l'acqua.

Mordant-Iodine

Lo iodio viene quindi aggiunto al campione per un minuto . Funziona come un mordente, che serve a fissare i coloranti in un processo di colorazione. Lo iodio svolge questa funzione legandosi al cristallo viola e creando un complesso insolubile che aderisce molto meglio allo spesso strato di peptidoglicano presente nelle cellule batteriche Gram-positive rispetto al solo cristallo viola. Non c'è una fase di lavaggio con acqua dopo aver aggiunto lo iodio.

Decolorizer-Alcool

Sia l'acetone che l'alcol etilico possono essere utilizzati come agente decolorante. L'alcol scioglie i lipidi che si trovano nella membrana cellulare esterna dei batteri Gram-negativi, permettendo al complesso di cristalli di iodio-violetto di fuoriuscire dallo strato di peptidoglicano più sottile. L'alcol viene aggiunto per 10-20 secondi; viene versato sulla diapositiva fino a quando tutto lo iodio viene lavato via e il deflusso è incolore. A questo punto del processo di colorazione Gram, i batteri Gram-negativi sono incolori mentre i batteri Gram-positivi mantengono ancora il cristallo viola. Una volta terminato, il vetrino deve essere risciacquato con acqua per arrestare l'effetto decolorante.

Controcolorazione-Safranina

La safranina viene quindi aggiunta per aumentare la visibilità e il contrasto con i batteri Gram-negativi incolori. La macchia fa apparire questi batteri rosa sotto il microscopio. Poiché la macchia viene aggiunta all'intero campione, anche essa colora i batteri Gram-positivi, ma il più scuro del cristallo viola nasconde il colore rosa safranin più leggero. Una volta che il campione di vetrino è stato inondato di safranina per circa un minuto, l'acqua viene utilizzata per rimuovere eventuali macchie in eccesso che non aderiscono alle cellule batteriche.