Il DNA ricombinante (l'acido desossiribonucleico è un tipo sintetico di acido nucleico creato collegando insieme sequenze di DNA che non sarebbero naturalmente presenti in circostanze normali e condizioni ambientali.Il processo di produzione del DNA ricombinante è fatto da un procedura avanzata in biologia e genetica nota come clonazione genica Il DNA ricombinante viene immesso in una cellula, che quindi produce una proteina completamente nuova e viene utilizzato per sintetizzare farmaci, anticorpi o proteine specifiche solo per scopi di ricerca.
Introduzione
Il DNA di un organismo donatore o di una fonte biologica viene prima estratto dalle cellule e quindi sottoposto a un processo di taglio noto come restrizione enzimatica, che genera frammenti di DNA che contengono il gene oi geni di interesse. "clonati" (cioè inseriti) o incollati su frammenti dall'organismo ricevente, vengono successivamente inseriti in molecole di DNA più grandi ("plasmidi"), che vengono posti in un batterio e lasciati moltiplicare. Il DNA ricombinante viene quindi recuperato e verificato.
Isolamento del DNA
Il DNA deve prima essere estratto e purificato da altre molecole cellulari, come gli acidi ribonucleici (RNA), le proteine e le strutture come le cellule membrane. Per scopi di clonazione, il DNA è ottenuto dal nucleo ed è noto come "DNA genomico". Un metodo comune per l'estrazione del DNA è l'ultracentrifugazione dei componenti cellulari in un gradiente di densità costituito da bromuro di etidio in cloruro di cesio. In alternativa, è possibile utilizzare una serie di lavaggi alcalini e tampone salino per recuperare il DNA. Una volta che questo è precipitato e pulito da tutti gli altri contaminanti indesiderati, il DNA può essere tagliato in frammenti.
Restrizione digestione enzimatica di DNA
Gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano sequenze di DNA molto specifiche; sono usati per creare frammenti di DNA unici. Questo processo garantisce che non vengano generate sequenze imprecise, errate o indesiderate e che vengano incorporate accidentalmente nel DNA ricombinante finale, che può provocare sia il fallimento sperimentale che la morte cellulare. Per generare i frammenti di DNA desiderati, uno specifico (o una combinazione di) enzima (s) è usato per tagliare o digerire il DNA. I frammenti vengono quindi purificati mediante elettroforesi su gel, che li separa dal DNA indesiderato. Un metodo più crudele implica semplicemente un taglio meccanico, che strappa i segmenti di DNA più lunghi in quelli più piccoli che possono essere utilizzati per la clonazione.
Legatura del DNA
La legatura è il processo di attaccare o unire il donatore e ricevente (o vettore) frammenti di DNA per creare una molecola di DNA ricombinante. Idealmente, gli enzimi di restrizione scelti per creare i frammenti sarebbero stati pensati e progettati molto attentamente in modo tale da consentire a questi bit di essere assemblati come un puzzle. Per fare questo, sono preferiti gli enzimi di restrizione che producono "estremità adesive" compatibili, in modo tale che tutti i frammenti compatibili si uniscano naturalmente tra loro; altrimenti, l'enzima DNA ligasi può essere utilizzato per unire i segmenti del DNA con legami fosfodiestere.
Replicazione del DNA ricombinante
Il processo di trasformazione o shock termico viene utilizzato per mettere la molecola di DNA ricombinante in un ospita una cellula batterica, che può quindi generare molte copie del DNA sintetico. Questi batteri sono cresciuti su piastre di agar, coltivate in speciali brodi batterici e poi lisate per rilasciare il DNA ricombinante. Infine, il DNA può essere verificato mediante sequenziamento del DNA, esperimenti funzionali e digestione degli enzimi di restrizione.
