I batteri vengono coltivati in piastre di Petri su un terreno solido noto come agar batterico, dove si formano colonie in rilievo, circolari. A differenza di una singola cellula batterica, una colonia è un gruppo di batteri abbastanza grande da essere visibile ad occhio nudo. La crescita batterica può essere misurata osservando semplicemente quante colonie sono presenti; tuttavia, più metodi quantitativi includono l'uso di una camera di conteggio o, più spesso, conteggi di piastre vitali. Quest'ultimo è usato più frequentemente in quanto fornisce anche informazioni qualitative come l'effetto delle diverse condizioni di crescita. Dal momento che potrebbero esserci miliardi di batteri in una capsula di Petri, la misurazione prima richiede la diluizione del campione in modo che sia possibile contare il numero di colonie.
In una provetta, aggiungere 10 microlitri della coltura batterica di partenza a 90 microlitri di mezzo di diluizione. Chiudere bene il coperchio del tubo e agitare delicatamente su vortex per ottenere una miscela omogenea. Ora il campione è un decimo della sua concentrazione originale.
Trasferire 10 microlitri di questo nuovo campione in una nuova provetta contenente 90 microlitri di mezzo di diluizione, mescolare nuovamente. Ancora una volta, il risultato sarà il campione ulteriormente diluito - ora sarà un centesimo della sua concentrazione originale. Ripetere l'operazione più volte, finché il campione originale non è stato diluito tra 10 4 e 10 10 volte. Assicurarsi che ogni provetta sia etichettata con la diluizione corretta, ad esempio 10 -1, 10 -2 e così via. Erogare 10 microlitri dell'ultima diluizione completata sulla piastra di agar. Utilizzando il bordo stenditore, distribuire la soluzione batterica su tutta la superficie della piastra di agar. Ripeti l'operazione per altre due piastre. È anche comune eseguire questi passaggi con altri livelli di diluizione per il confronto. Assicurati di etichettare il fondo delle piastre. Sostituire i coperchi su ciascuna piastra e lasciare asciugare le piastre di agar per diversi minuti su un banco di laboratorio sotto una fiamma o in un incubatore. Posizionare le piastre nell'incubatore che dovrebbe essere impostato alla temperatura appropriata per il ceppo batterico. Lasciare crescere per 12-16 ore. Le colonie dovrebbero essere visibili dopo 16 ore; tuttavia, alcune modifiche genetiche potrebbero richiedere più tempo (ad esempio, lo sviluppo del colore). Quando le colonie sono osservabili, estrai i piatti e trova quelli che hanno tra 30 e 300 colonie. Utilizzando un pennarello indelebile, posiziona un punto sul fondo della capsula di Petri - il lato con l'agar, non il coperchio - ovunque sia visibile una colonia attraverso l'agar. Contare ciascun punto del marker. Ripeti per ogni piatto. Per misurare la quantità di batteri nella coltura iniziale per questo esperimento, la diluizione deve essere invertita nei calcoli, in due punti. In primo luogo, quando prendevi un microlitro dalla provetta per inserire la capsula di Petri, prendevi un decimo del campione diluito, quindi devi moltiplicare tutto per 10 per invertire quella. Inoltre, se il fattore di diluizione nella provetta era, ad esempio, 10 -7, allora il numero di colonie deve essere moltiplicato per 10 7 per invertire l'effetto di diluizione. Basta rimuovere il segno negativo dall'esponente nei calcoli. Utilizzare la formula: [Numero di colonie contate] × 10 × [quante volte il campione deve essere moltiplicato per raggiungere la concentrazione originale: ad esempio, 10 5] = Numero di unità di formazione di colonie (CFU) per millilitro di coltura iniziale. Questa è la crescita batterica nelle tue piastre di Petri. TL; DR (Troppo lungo, non letto) Assicurati di sterilizzare lo spargitore di vetro immergendo il bordo di diffusione in 70% di etanolo e inserendolo in una fiamma di bruciatore Bunsen. Consentire all'etanolo di prendere fuoco e bruciare lentamente l'alcol, che ucciderà tutta la contaminazione batterica. Toccarlo delicatamente sull'agar (cioè senza batteri) per raffreddarlo - l'agar non deve sciogliersi al contatto. Avvertenza Trattare eventuali batteri come se fosse potenzialmente patogeno e utilizzare procedure di sicurezza adeguate per il laboratorio.
