1. Fase stazionaria:
* Natura della fase stazionaria: Materiali diversi come gel di silice, allumina, cellulosa o resine a scambio ionico presentano polarità e affinità diverse per diversi composti. Ciò impone quali composti interagiranno più fortemente e quindi eluteranno in seguito.
* Dimensione delle particelle e porosità: Le particelle più piccole e una maggiore porosità forniscono una maggiore superficie per l'interazione con l'analita, migliorando l'efficienza di separazione.
* Attività della fase stazionaria: L'attività del gel di silice può essere regolata con un variabile contenuto d'acqua, che influenza la resistenza dell'interazione con i composti polari.
2. Fase mobile:
* Natura del solvente: La polarità della fase mobile influenza il suo potere eluito. Un solvente più polare elulerà i composti polari più velocemente, mentre un solvente meno polare manterrà i composti polari più a lungo.
* Stensione del solvente: I solventi più forti interagiscono più fortemente con l'analita e li elinano più velocemente. Questo può essere regolato utilizzando diversi solventi o mescolandoli in diversi rapporti (eluizione a gradiente).
* Portata a flusso: Una portata più lenta consente un maggiore equilibrio tra le fasi stazionarie e mobili, con conseguente migliore separazione. Tuttavia, le portate eccessivamente lente possono portare all'ampliamento della banda.
3. Esempio:
* Dimensione del campione: Le dimensioni del campione più grandi possono sovraccaricare la colonna, portando a una scarsa separazione.
* Composizione campione: Le miscele complesse possono essere difficili da separare e alcuni componenti potrebbero interferire tra loro.
* Solubilità del campione: Il campione dovrebbe essere solubile nella fase mobile per garantire un'eluizione adeguata.
4. Dimensioni della colonna:
* Lunghezza della colonna: Le colonne più lunghe forniscono più superficie per l'interazione, migliorando la separazione.
* Diametro della colonna: Una colonna più stretta aumenta la risoluzione ma limita anche la dimensione del campione.
5. Temperatura:
* La temperatura influisce sulla solubilità dell'analita e la viscosità della fase mobile. Temperature più elevate in genere portano a un'eluizione più rapida e talvolta possono migliorare la separazione.
6. Altri fattori:
* Pressione: L'applicazione della pressione può aumentare la portata, ma può anche influire sull'efficienza di separazione.
* Tipo di colonna: Diversi progetti di colonne, come colonne confezionate o colonne tubolari aperte, possono influire sulla separazione.
Nel complesso, la separazione riuscita nella cromatografia a colonna si basa sulla scelta della giusta combinazione di fasi stazionarie e mobili, ottimizzando le condizioni operative e considerando le proprietà del campione.
