1. Isolamento del gene di interesse:
* Fonte: Il gene desiderato è ottenuto dal suo organismo originale (ad esempio batteri, piante, animali).
* Metodi: Questo può comportare:
* Digestione degli enzimi di restrizione: Gli enzimi specifici tagliano il DNA a sequenze precise.
* PCR (reazione a catena della polimerasi): Amplifica un frammento di DNA specifico.
2. Preparazione del vettore:
* Scelta del vettore: Viene selezionato un vettore adatto (ad es. Plasmide, virus). Il vettore deve essere in grado di replicare nella cella ospite.
* Digestione degli enzimi di restrizione: Il vettore viene tagliato con lo stesso enzima di restrizione utilizzato per il gene di interesse, creando estremità compatibili.
* Legation: Il gene di interesse e il vettore aperto sono combinati usando il DNA ligasi, che sigilla il DNA insieme.
3. Trasformazione:
* Introduzione nella cella ospite: Il DNA ricombinante viene introdotto in una cellula ospite (ad esempio batteri, lievito).
* Metodi: I metodi comuni includono:
* Trasformazione chimica: Le cellule sono trattate con sostanze chimiche che aumentano la permeabilità al DNA.
* Elettroporazione: Un breve impulso elettrico crea pori temporanei nella membrana cellulare.
4. Selezione di cellule trasformate:
* Geni marker: Il vettore trasporta spesso geni marker (ad es. Resistenza agli antibiotici) che consentono l'identificazione di cellule contenenti il DNA ricombinante.
* Crescita sui media selettivi: Le cellule sono coltivate su media contenenti l'antibiotico. Solo le cellule con il gene marker sopravviveranno e si moltiplicheranno.
5. Produzione del prodotto genico:
* Espressione: Le cellule trasformate vengono coltivate in grandi quantità e il gene di interesse è espresso.
* Produzione di proteine: Il DNA del gene viene trascritto nell'mRNA, che viene quindi tradotto nella proteina desiderata.
* Purificazione (opzionale): Se la proteina è il prodotto desiderato, può essere purificato per rimuovere altri componenti cellulari.
Punti chiave da ricordare:
* Enzimi di restrizione: Questi si comportano come forbici molecolari, che tagliano il DNA a sequenze specifiche, lasciando "estremità appiccicose" che possono basare con le estremità compatibili su altri frammenti di DNA.
* Vettori: Questi sono veicoli che portano il gene di interesse nella cella ospite. I plasmidi sono pezzi circolari di DNA che si replicano indipendentemente nei batteri. I vettori virali possono integrare il gene nel genoma dell'ospite.
* Geni marker: Questi geni consentono la selezione di cellule trasformate.
* Efficienza di trasformazione: Il processo di introduzione di DNA estraneo nelle cellule non è efficiente al 100%. Non tutte le cellule occupano con successo il DNA ricombinante.
Fammi sapere se vuoi maggiori dettagli su qualsiasi aspetto specifico di questo processo!
