Questo protocollo delinea un metodo di base per estrarre il DNA genomico dalle foglie di arachidi usando un approccio semplice ed economico.
Materiali:
* Foglie arachidi (fresche o congelate)
* Azoto liquido
* Mortaio e pestello
* 1,5 ml di tubi di microcentrifuga
* 100 mm Tris-HCl (pH 8,0)
* 25 mm EDTA (pH 8,0)
* 1,4 m NaCl
* 10% SDS (dodecil solfato di sodio)
* Cloroformio:alcool isoamilico (24:1)
* Isopropanolo
* 70% di etanolo
* Rnase a soluzione (10 mg/ml)
* Spettrofotometro
Procedura:
1. Preparazione del campione:
* Raccogli le foglie di arachidi fresche o congelate. Se si usano foglie congelate, scongelarle a temperatura ambiente.
* Pesare circa 0,1-0,2 g di tessuto fogliare.
* Posizionare le foglie in un mortaio pre-rettificato e macinarle a una polvere fine usando azoto liquido.
2. Lisi:
* Trasferire le foglie in polvere su una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml.
* Aggiungi 500 µL di tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA da 25 mM, pH 8,0, 1,4 M NaCl e 10% SDS).
* Incubare il tubo a 65 ° C per 30 minuti con occasionali scuotimento delicato. Questo passaggio rompe le pareti cellulari e le membrane, rilasciando il DNA.
3. Rimozione della proteina:
* Aggiungi 200 µl di cloroformio:alcool isoamilico (24:1) al tubo.
* Scuoti vigorosamente il tubo per 10 minuti.
* Centrifugare il tubo a 10.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio separa la soluzione in tre strati:strato acquoso (in alto), interfase (medio) e strato organico (in basso). Il DNA è nello strato acquoso.
4. precipitazione del DNA:
* Trasferire con cura lo strato acquoso su una nuova tuba di microcentrifuga da 1,5 ml.
* Aggiungere 0,5 volume di isopropanolo al tubo e mescolare delicatamente. Ciò precipiterà il DNA dalla soluzione.
* Incubare il tubo a -20 ° C per 30 minuti.
* Centrifugare il tubo a 10.000 x g per 10 minuti a 4 ° C. Il pellet di DNA si formerà nella parte inferiore del tubo.
5. Lavaggio e asciugatura:
* Rimuovere il surnatante e lavare il pellet di DNA con 500 µL di etanolo al 70%.
* Centrifugare il tubo a 10.000 x g per 5 minuti a 4 ° C.
* Rimuovere l'etanolo e asciugare l'aria il pellet per 5-10 minuti.
6. Resuspension e RNASE Trattamento:
* Risospendere il pellet DNA in 50 µl di tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0).
* Aggiungi 1 µL di soluzione RNase A (10 mg/mL) al tubo.
* Incubare il tubo a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere qualsiasi RNA rimanente.
7. Quantificazione del DNA e controllo della qualità:
* Quantificare il DNA estratto usando uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 260 nm e 280 nm. Il rapporto di assorbanza a 260 nm/280 nm dovrebbe essere compreso tra 1,8 e 2,0, indicando il DNA puro.
Note:
* Questo protocollo è una linea guida di base e potrebbe essere necessario adattare in base al materiale fogliare specifico e alla qualità desiderata del DNA.
* Indossa sempre guanti e cappotti da laboratorio durante la gestione di campioni biologici.
* Assicurarsi che tutti i reagenti e le attrezzature siano sterili per evitare la contaminazione.
* È inoltre possibile utilizzare i kit di estrazione del DNA commerciale per un processo più snello ed efficiente.
Ulteriori applicazioni:
* Il DNA genomico isolato può essere utilizzato per varie applicazioni di biologia molecolare, tra cui:
* PCR (reazione a catena della polimerasi)
* Sequenziamento del DNA
* Analisi genetica
* Clonazione
Questo protocollo fornisce un metodo semplice ed economico per isolare il DNA genomico dalle foglie di arachidi, aprendo la strada a varie ricerche e applicazioni.
