1. Ottenere il gene umano di interesse
* Isolamento dal DNA umano: Il gene umano desiderato viene estratto dalle cellule umane usando tecniche come la digestione degli enzimi di restrizione o la PCR (reazione a catena della polimerasi).
* Sintesi: Il gene può anche essere sintetizzato artificialmente, usando la tecnologia di sintesi genica, che è spesso più efficiente per geni complessi.
2. Preparazione del vettore del plasmide
* Selezione del plasmide: Viene scelto un vettore di plasmide adatto, spesso uno con più siti di clonazione (MCS), geni di resistenza agli antibiotici e altre caratteristiche che facilitano la clonazione.
* Digestione degli enzimi di restrizione: Il plasmide viene aperto in siti specifici usando enzimi di restrizione, creando "estremità appiccicose" compatibili con il gene umano.
3. Legatura (unione) del gene e del plasmide
* Compatibilità: Le estremità appiccicose del gene umano e del plasmide linearizzato sono progettate per essere compatibili, consentendo loro di legarsi insieme attraverso l'accoppiamento di base complementare.
* enzima ligasi: La ligasi del DNA viene utilizzata per catalizzare la formazione di legami fosfodiestri, unendosi permanentemente al gene umano nel plasmide.
4. Trasformazione in batteri
* Celle competenti: Le cellule batteriche sono rese "competenti" per assumere il DNA con vari metodi, come scosse di calore o elettroporazione.
* Introduzione: I plasmidi ricombinanti vengono introdotti nei batteri competenti.
* Selezione: I batteri che hanno raccolto con successo il plasmide vengono selezionati coltivandoli su media contenenti antibiotici. Solo i batteri con il plasmide cresceranno a causa del gene della resistenza agli antibiotici.
5. Verifica e conferma
* Colony PCR: La PCR viene utilizzata per confermare la presenza del gene umano all'interno delle colonie batteriche.
* Sequenziamento: La sequenza genica inserita viene verificata mediante sequenziamento del DNA per assicurarsi che sia corretto e intatto.
Componenti e considerazioni chiave:
* Enzimi di restrizione: Questi enzimi tagliano il DNA a sequenze specifiche, creando estremità compatibili per la legatura.
* DNA ligasi: Questo enzima si unisce alle estremità dei fili del DNA insieme.
* Marcatori di resistenza agli antibiotici: Questi geni sul plasmide consentono la selezione di batteri che hanno incorporato con successo il plasmide.
* MCS (più siti di clonazione): Questa regione del plasmide contiene più siti enzimi di restrizione, consentendo l'inserimento di geni diversi.
Perché è importante?
* Produzione di proteine: I batteri ricombinanti possono essere usati per produrre grandi quantità di proteine umane, come l'insulina o l'ormone della crescita, a scopi terapeutici.
* Strumenti di ricerca: I plasmidi ricombinanti sono essenziali per gli studi di clonazione genica e espressione genica.
* Terapia genica: In alcuni casi, i plasmidi ricombinanti contenenti geni terapeutici possono essere usati per fornire geni correttivi alle cellule nella terapia genica.
Nota: I dettagli specifici del processo possono variare a seconda del gene clonato, dell'ospite batterico e dell'applicazione desiderata.
