La clonazione funzionale, nota anche come clonazione posizionale, mira a isolare un gene basato sul suo fenotipo e sulla sua posizione cromosomica. Ecco i passaggi chiave coinvolti:
1. Identifica un fenotipo di interesse:
- Inizia con una chiara comprensione del fenotipo che si desidera clonare. Questa potrebbe essere una malattia, un tratto di sviluppo o qualsiasi altra caratteristica osservabile.
2. Mappa il gene su una regione cromosomica specifica:
- Analisi del collegamento: Analizzare i modelli di segregazione del fenotipo con marcatori genetici noti (come SNP o microsatelliti) in una famiglia o una popolazione. Identificare i marcatori che si scregano con il fenotipo, suggerendo che sono vicini al gene di interesse.
- Studi di associazione: Correlare il fenotipo con varianti genetiche specifiche (SNP) in un approccio basato sulla popolazione. Questo aiuta a individuare le regioni nel genoma associato al fenotipo.
- Delzioni/duplicazioni cromosomiche: Esamina le persone con riarrangiamenti cromosomici. Se il fenotipo è influenzato da una cancellazione o duplicazione in una regione specifica, suggerisce che il gene responsabile si trova all'interno di quella regione.
3. Stringere la regione del candidato:
- mappatura fine: Impiegare marcatori genetici ad alta densità e famiglie/popolazioni aggiuntive per perfezionare la posizione del gene all'interno della regione precedentemente identificata.
- Mappatura fisica: Usa metodi fisici come il cromosoma che cammina e il salto cromosomico per stabilire una mappa fisica della regione, identificando cloni sovrapposti.
- Identificazione del gene candidato: Identificare tutti i geni presenti all'interno della regione ristretta utilizzando database genomici disponibili.
4. Clone e analizzare i geni candidati:
- Clonazione genica: Isolati e sequenza frammenti di DNA contenenti i geni candidati usando tecniche come la PCR o lo screening della libreria.
- Analisi dell'espressione: Esamina il modello di espressione dei geni candidati nei tessuti rilevanti per il fenotipo.
- Studi funzionali: Condurre test funzionali (come studi in vitro o in vivo) per determinare il ruolo dei geni candidati nel fenotipo. Questo può comportare:
- sovraespressione o knockdown del gene
- Studiare gli effetti delle mutazioni nel gene
- Studio delle interazioni proteiche del prodotto genico
5. Convalida e conferma:
- Studi indipendenti: Replicare i risultati in diverse popolazioni o modelli sperimentali.
- Modelli animali: Crea modelli animali con mutazioni nel gene identificato per confermare il suo ruolo nel fenotipo.
- Potenziale terapeutico: Valuta il gene e i suoi prodotti per potenziali applicazioni terapeutiche.
Nota importante:
- La clonazione funzionale è spesso un processo complesso e che richiede tempo.
- Richiede un'analisi genetica estesa, tecniche di biologia molecolare e competenza biologica.
- Il successo della clonazione funzionale dipende dalla disponibilità di risorse genetiche appropriate, dalla complessità del fenotipo e dall'architettura genetica del tratto.
alternative alla clonazione funzionale:
- Sequenziamento di prossima generazione: Consente il sequenziamento dell'intero genoma o dell'esoma, facilitando l'identificazione di geni associati a fenotipi specifici.
- Studi sull'associazione a livello del genoma (GWAS): Fornire un potente strumento per rilevare varianti genetiche associate a tratti complessi, sebbene possano non identificare direttamente i geni causali.
- Genetica inversa: Inizia con un gene e studia la sua funzione utilizzando strumenti di editing genico come CRISPR-Cas9.
La clonazione funzionale ha svolto un ruolo cruciale nella comprensione delle basi genetiche di varie malattie e tratti, contribuendo in modo significativo al progresso della medicina e della biologia. Tuttavia, con l'avvento di nuove tecnologie, gli approcci alternativi stanno diventando sempre più importanti nella ricerca genetica.
