Di Nitu Bansal | Aggiornato il 24 marzo 2022

La clonazione TA offre un approccio semplice e privo di restrizioni per la subclonazione dei prodotti PCR. La tecnica sfrutta l'accoppiamento complementare di timina e adenina, consentendo la legatura diretta senza la necessità di enzimi di restrizione. L'amplificazione PCR viene generalmente eseguita con la Taq polimerasi, che aggiunge una singola sporgenza 3′-adenina a ciascun filamento di DNA.

Metodo

Nella clonazione TA, un vettore linearizzato, noto come vettore T, contiene singole sporgenze 3′‑T. Il prodotto della PCR, che presenta sporgenze di 3′‑A, viene miscelato con il vettore T in un rapporto molare elevato. Alla miscela viene quindi aggiunta la ligasi del DNA T4, consentendo alle coppie A‑T complementari di ricotturarsi e sigillarsi, ottenendo un plasmide ricombinante.

Vantaggi e svantaggi

Pro:

• Protocollo veloce e semplice:non sono richiesti enzimi di restrizione.
• Ideale per clonare frammenti privi di siti di restrizione adeguati.
• Elevata efficienza di legatura quando si utilizzano vettori T di alta qualità.

Contro:

• I kit commerciali possono essere costosi e limitarne l'uso diffuso.
• La clonazione non direzionale aumenta la possibilità di inversione dell'orientamento dell'inserto.

Kit di clonazione TA

I principali produttori forniscono kit di clonazione TA pronti all'uso, tra cui Invitrogen, QIAGEN e Premier Biosoft. Questi kit forniscono vettori T pre-preparati e reagenti di legatura ottimizzati per semplificare il flusso di lavoro.