Uno schema di sviluppo di Gamillus. Il gene della proteina fluorescente è stato clonato da tentacoli di meduse cappello di fiori, ed è stato progettato per migliorare la proprietà monomerica e la luminosità. (La medusa con cappello a fiori è stata fornita dal signor Kamoizumi nell'acquario di Kamo, Yamagata, Giappone.) Credito:Acquario e Università di Osaka
I ricercatori dell'Università di Osaka sviluppano una nuova proteina fluorescente verde in grado di resistere a un ambiente a pH basso per l'imaging di organelli acidi
Visualizzare componenti e processi cellulari a livello molecolare è importante per comprendere le basi di qualsiasi attività biologica. Le proteine fluorescenti (FP) sono uno degli strumenti più utili per studiare le dinamiche molecolari intracellulari.
Però, Gli FP hanno limitazioni di utilizzo per l'imaging in ambienti a pH basso, come negli organelli acidi, inclusi endosomi, lisosomi, e vacuoli vegetali. In ambienti con pH inferiore a 6, la maggior parte degli FP perdono la loro luminosità e stabilità a causa del loro pKa neutro. pKa è la misura della forza acida; più piccolo è il pKa, più la sostanza è acida.
"Sebbene ci siano segnalazioni di diversi FP verdi tolleranti agli acidi (GFP), la maggior parte ha gravi inconvenienti. Per di più, c'è una mancanza di GFP acido-tolleranti che sono praticamente applicabili al bioimaging, "dice Hajime Shinoda, autore principale di uno studio dell'Università di Osaka che mirava a progettare la GFP monomerica tollerante all'acido che sia praticamente applicabile all'imaging di cellule vive negli organelli acidi. "Nel presente studio, abbiamo sviluppato un GFP acido-tollerante. L'abbiamo chiamato Gamillus."
Figura 2. (Sinistra) proprietà di fluorescenza dipendente dal pH di Gamillus e EGFP. (A destra) Immagini di fluorescenza di cellule HeLa che esprimono Gamillus o EGFP. Gamillus consente l'osservazione in fluorescenza della migrazione delle proteine ai lisosomi causata dalla macroautofagia. Barra della scala, 10 micron. Credito:Università di Osaka
Gamillus è una GFP clonata da Olindias formosa (medusa con cappello a fiori) e mostra una tolleranza agli acidi superiore (pKa=3.4) e una luminosità quasi doppia rispetto alle GFP riportate. Lo spettro di fluorescenza è costante tra pH4,5 e 9,0, che rientra nell'intervallo intracellulare nella maggior parte dei tipi di cellule. Cristallografia a raggi X (tecnica utilizzata per determinare la struttura atomica e molecolare di un cristallo, in questo caso, un cristallo di Gamillus) e la mutagenesi puntiforme suggeriscono che la tolleranza acida di Gamillus sia attribuita alla stabilizzazione della deprotonazione nella sua struttura chimica. I risultati sono stati pubblicati in Biologia chimica cellulare .
"L'applicabilità di Gamillus come tag molecolare è stata dimostrata dal corretto modello di localizzazione delle fusioni di Gamillus in una varietà di strutture cellulari, compresi quelli difficili da prendere di mira, " L'autore corrispondente Takeharu Nagai dice. "Crediamo che Gamillus possa essere un potente strumento molecolare per indagare su fenomeni biologici sconosciuti che coinvolgono organelli acidi, come l'autofagia".
