Un team di ricercatori guidato dal Dr. Mike Sleutel del VIB-VUB Center for Structural Biology in collaborazione con scienziati dell'Institute for Complex Molecular Systems della Eindhoven University of Technology, e il CNRS di Grenoble, hanno scoperto per la prima volta i dettagli molecolari della nucleazione dei cristalli di proteine, un processo di grande rilevanza medica e scientifica. Il team ha anche sviluppato una nuova metodologia per studiare un'ampia classe di sistemi che fino ad oggi sono rimasti inafferrabili. I loro risultati sono pubblicati in Natura .
Dr. Mike Sleutel (VIB-VUB):"Sarà emozionante vedere questa nuova tecnica applicata in futuro per seguire i processi di autoassemblaggio delle proteine che sono implicati in una serie di disturbi patologici, come la separazione di fase liquido-liquido nella formazione della cataratta oculare o la formazione di fibre amiloidi associate a una serie di disturbi neurologici".
I cristalli di proteine hanno una grande rilevanza medica e scientifica. Per decenni, sono stati essenziali per i biologi strutturali per risolvere le strutture tridimensionali delle proteine, ma i cristalli proteici sono anche usati come agenti di consegna biofarmaceutici. Le sospensioni cristalline sono formulazioni attraenti per conservare e somministrare composti farmaceutici attivi a causa della loro durata di conservazione a lungo termine, bassa viscosità del solvente, e lenta velocità di dissoluzione. Forse l'esempio più noto è l'insulina:le iniezioni di insulina comprendono l'iniezione sottocutanea di una sospensione di microcristalli di insulina che si dissolvono lentamente per produrre una somministrazione costante e sostenuta nel tempo. Nonostante il loro enorme potenziale, ci sono due fattori che limitano l'uso dei cristalli proteici in una vasta gamma di applicazioni.
Sfide nello sviluppo di cristalli proteici
Primo, cristalli di proteine in crescita, come diranno molti biologi molecolari, è più un'arte che una scienza. Infatti, per molte proteine, la cristallizzazione può essere estremamente difficile. Ciò deriva in parte dal fatto che gli scienziati non comprendono le prime fasi della formazione dei cristalli di proteine. Qualsiasi cristallo ha origine da un nucleo, un minuscolo seme cristallino, che si forma per raggruppamento spontaneo di poche molecole in soluzione che devono adottare un'organizzazione regolare nelle tre dimensioni. Il modo in cui le molecole realizzano questa impresa improbabile è rimasto un mistero fino a questo punto.
In secondo luogo, una singola proteina può cristallizzare in molteplici forme cristalline diverse, questo è noto come polimorfismo. Diversi polimorfi di cristallo hanno caratteristiche diverse, con i più notevoli il potere di diffrazione dei raggi X (fondamentale per la determinazione della struttura 3D), e la velocità con cui si dissolve (cruciale per la somministrazione di farmaci). Come ancora, è molto difficile guidare il processo di cristallizzazione al polimorfo di proprio gradimento. Gli scienziati ritengono che la selezione dei polimorfi avvenga nella fase di nucleazione, ma nessuno sa esattamente come funziona il meccanismo.
Un nuovo modo di guardare all'autoassemblaggio delle macromolecole
Il gruppo di scienziati guidato dal Dr. Mike Sleutel ha utilizzato la microscopia elettronica a criotrasmissione (Cryo-TEM) all'avanguardia per catturare la nascita di un cristallo proteico visualizzando il processo di nucleazione a risoluzione molecolare.
Il Dr. Heiner Friedrich spiega:"Poiché il processo avviene così rapidamente, e su una scala di lunghezza così ridotta avevamo bisogno di arrestare criogenicamente il campione in varie fasi del processo. Una volta congelato nel tempo, usiamo un microscopio elettronico molto sensibile per visualizzare le proteine e come si raggruppano per formare un nucleo e infine il cristallo proteico".
Analizzando le immagini Cryo-TEM prelevate da una serie di campioni a intervalli di tempo costanti, potrebbero iniziare a mettere insieme la serie di collisioni molecolari che devono aver luogo per formare un nucleo cristallino. Il Dr. Mike Sleutel continua:"Siamo rimasti colpiti dall'inaspettata complessità del processo, che si è rivelato molto più intricato dei modelli operativi che noi e altri nel campo avevamo prima di queste osservazioni. Per la proteina che abbiamo usato nel nostro studio abbiamo scoperto un processo di autoassemblaggio gerarchico che coinvolge tre fasi successive di autoassemblaggio su scale di lunghezza sempre crescenti." Queste osservazioni sono le prime del loro genere e forniscono un nuovo modo di guardare al processi di autoassemblaggio di macromolecole in strutture più grandi.
Ma la squadra è andata anche oltre, e confrontato le vie di nucleazione di più polimorfi. Hanno mostrato che la selezione dei polimorfi è dettata dall'architettura dei frammenti più piccoli possibili formati nei primi momenti. Una volta formate tali strutture, la fede del sistema è impostata. Il Dr. Alexander Van Driessche spiega:"Analizzando e comprendendo le differenze nella struttura dei vari nuclei, abbiamo sviluppato strategie per guidare il processo di selezione dei polimorfi. Abbiamo raggiunto questo obiettivo modificando delicatamente le diverse modalità di interazione che esistono tra le molecole, guidare il processo di nucleazione nella direzione da noi scelta." Il team ritiene che le nuove intuizioni e la metodologia faranno avanzare in modo significativo lo sviluppo di cristalli proteici per la determinazione della struttura 3D e le applicazioni mediche.
