Ricercatori del Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley Lab) e dell'Università della California, Berkeley ha combinato la microscopia crioelettronica all'avanguardia (crio-EM) con la modellazione molecolare computazionale per produrre un modello a risoluzione quasi atomica dell'interazione tra i microtubuli, componenti cruciali dell'ultrastruttura delle cellule eucariotiche, e le proteine ​​associate ai microtubuli chiamate tau.

Il modello fornisce informazioni su come la tau stabilizza i microtubuli, e cosa lo fa dissociare per formare aggregati tau, o "grovigli, " in alcune malattie neurologiche, compreso il morbo di Alzheimer, generalmente chiamate taupatie.

I microtubuli svolgono un ruolo importante nel mantenimento della forma cellulare, consentendo alcune forme di locomozione, facilitando il trasporto intracellulare, e la segregazione dei cromosomi durante la mitosi. Ogni microtubulo è un cilindro cavo composto da tredici protofilamenti paralleli di proteina tubulina.

Tau aiuta a mantenere stabili i microtubuli e li organizza in fasci. Mutazioni o modifiche post-traduzionali, come l'iperfosforilazione, che riducono l'affinità della tau per i microtubuli si pensa che contribuiscano alla formazione di grovigli di tau.

Il gruppo, guidata da Eva Nogales, uno scienziato senior della facoltà nella divisione di biofisica molecolare e bioimmagini integrate (MBIB) presso il Berkeley Lab e un investigatore e professore dell'Howard Hughes Medical Institute presso l'UC Berkeley, utilizzato cryo-EM per l'immagine di tau adulta nativa a figura intera legata ai microtubuli con una risoluzione complessiva di 4,1 A?. Hanno mostrato che la tau si attacca longitudinalmente lungo la cresta dei filamenti di tubulina, un risultato coerente con un precedente studio crio-EM a bassa risoluzione.

Tau è una proteina intrinsecamente disordinata che include un dominio di proiezione, una regione di legame dei microtubuli di quattro ripetizioni di sequenza imperfette, e un dominio C-terminale. La tubulina è un dimero, il che significa una coppia congiunta di polipeptidi strettamente correlati, in questo caso α-tubulina e -tubulina. I dimeri di tubulina vengono messi insieme (o polimerizzano) dalla testa alla coda per formare i protofilamenti che costituiscono i microtubuli.

"Data la vasta letteratura sulla sua mancanza di una struttura regolare, non eravamo sicuri che la tau avrebbe effettivamente formato interazioni ordinate con la tubulina, " ha detto Elizabeth Kellogg, un ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Nogales e co-primo autore dell'articolo che presenta il lavoro, pubblicato il 10 maggio sulla rivista Scienza .

Per testare ipotesi su quali residui di tau siano coinvolti nel legame alla tubulina, hanno quindi creato costrutti sintetici di tau con regioni di legame ai microtubuli composte da quattro ripetizioni identiche e hanno ripreso anche quelle attaccate ai microtubuli (risoluzione complessiva 3,2-3,9 ). Simon Poepsel, un ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Nogales, aveva lavorato con la forma amiloide della tau da studente laureato ed è stato determinante nella purificazione e nella preparazione dei campioni per la crio-EM.

"Quando siamo stati finalmente in grado di vedere la lunghezza di una ripetizione tau e vedere che aveva una struttura definita e un sito di legame, ci siamo resi conto che la tau stava in effetti formando interazioni specifiche con la superficie della tubulina, " ha detto Kellogg. "Quando siamo stati in grado di conciliare questo con la lunghezza di una ripetizione e le informazioni sulla sequenza che avevamo, era la chiave di cui avevamo bisogno per capire come migliorare sufficientemente le ricostruzioni per consentire la modellazione atomica".

La squadra si è poi rivolta a Rosetta, una suite completa di strumenti di modellazione computazionale per prevedere le strutture atomiche tridimensionali delle macromolecole dalle informazioni sulla sequenza di amminoacidi, in base alla conformazione con lo stato energetico più basso. Le mappe crio-EM ad alta risoluzione hanno permesso al team di porre dei vincoli sulla forma complessiva del complesso molecolare, aumentare la fedeltà del modello, Nogales ha spiegato.

Frank Di Maio, professore associato presso il dipartimento di biochimica e l'Institute for Protein Design presso l'Università di Washington, ha contribuito con la sua esperienza lavorando con la piattaforma Rosetta, in particolare la funzione "fit to density" utilizzando dati crio-EM.

Rosetta structure predictions for two different synthetic tau constructs converged on the same solution:a backbone stretch of 27 residues spanning three tubulin monomers. "The identical sequence register and atomic details from two independent maps underscores the robustness of our solution and provides high confidence in the accuracy of our atomic models, " Nogales said.

"Our structure shows how tau's main contact with the microtubule surface is at the interface between tubulin subunits, serving as a 'stapler' to promote the association between tubulin subunits and explaining how tau promotes microtubule stability, " said Kellogg. "The structure also explains how tau phosphorylation leads to its dissociation from microtubules."

Phosphorylation of the serine at position 262 (universally conserved among tau repeats) has been observed to attenuate microtubule binding and is a marker of Alzheimer's disease. The model shows that phosphorylation at this crucial anchor point would disrupt interaction between tau and the microtubule and thus cause the "staples to fall off". Additional residues that are critical for tau-microtubule binding were identified as well.