Schema della tecnologia CFGpS single-pot. E. coli glicoingegnerizzati modificati con (i) mutazioni genomiche che favoriscono le reazioni di glicosilazione e (ii) DNA plasmidico per la produzione di componenti di glicosilazione essenziali (cioè, OST, LLO) servono come ceppo sorgente per la produzione di estratti grezzi di S30. I componenti di glicosilazione candidati possono essere derivati da tutti i regni della vita e includono OST a subunità singola come C. jejuni PglB e LLO con N-glicani di C. jejuni che sono assemblati su Und-PP dagli enzimi della via Pgl. Dopo la preparazione dell'estratto mediante lisi del ceppo di origine, la biosintesi one-pot delle N-glicoproteine viene avviata adescando l'estratto con il DNA che codifica per la proteina accettore di interesse. Credito: Comunicazioni sulla natura (2018). DOI:10.1038/s41467-018-05110-x
Ingegneria della biologia cellulare, meno la cella reale, è un'area di crescente interesse per le biotecnologie e la biologia sintetica. È noto come sintesi proteica priva di cellule, o CFPS, e ha il potenziale per fornire modi sostenibili per produrre prodotti chimici, medicinali e biomateriali.
Sfortunatamente, una lacuna di vecchia data nei sistemi privi di cellule è la capacità di produrre proteine glicosilate, proteine con un legame di carboidrati. La glicosilazione è cruciale per una vasta gamma di importanti processi biologici, e la capacità di comprendere e controllare questo meccanismo è vitale per il trattamento e la prevenzione delle malattie.
Matteo De Lisa, il William L. Lewis Professor of Engineering presso la Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering presso la Cornell University, e Michael Jewett, professore associato di ingegneria chimica e biologica presso la Northwestern University, hanno collaborato a un nuovo approccio che colma questo divario. Il loro sistema, il primo del suo genere, sfrutta i recenti progressi nella CFPS aggiungendo il componente cruciale della glicosilazione in modo semplificato, reazione "one-pot". La proteina scelta potrebbe quindi essere liofilizzata e riattivata per la sintesi al punto d'uso semplicemente aggiungendo acqua.
DeLisa e Jewett sono co-autori senior di "Biosintesi della glicoproteina a vaso singolo che utilizza un sistema di trascrizione-traduzione privo di cellule arricchito con macchinari di glicosilazione, " pubblicato il 12 luglio in Comunicazioni sulla natura .
Thapakorn Jaroentomeechai, dottorato di ricerca studente del gruppo di ricerca DeLisa, e Jessica Stark '12, dottorato di ricerca studente del gruppo Jewett, sono co-primi autori.
"Se vuoi davvero avere un utile, vaccino portatile e dispiegabile o tecnologia proteica terapeutica priva di cellule, devi capire l'attaccamento ai carboidrati, " DeLisa ha detto. "Cioè, in sostanza, quello che abbiamo fatto in un modo molto potente".
Questo lavoro potrebbe avere un impatto sullo sviluppo di strategie di produzione decentralizzate. Il rapido accesso ai farmaci a base di proteine in contesti remoti potrebbe cambiare la vita; nuovi paradigmi di bioproduzione adatti per l'uso in contesti con risorse limitate potrebbero promuovere un migliore accesso a farmaci costosi attraverso produzione in piccoli lotti.
DeLisa ha svolto molte ricerche sui meccanismi molecolari alla base della biogenesi delle proteine nell'ambiente complesso di una cellula vivente, come Escherichia coli ( E. coli ). Mentre il suo laboratorio ha fatto alcune scoperte importanti, i limiti di quest'area, Egli ha detto, sono le stesse pareti cellulari.
Il laboratorio di Jewett alla Northwestern ha investito gran parte dei suoi sforzi di ricerca nella biologia sintetica priva di cellule, che sfrutta i biomacchinari più eleganti della natura al di fuori dei confini della cellula, quindi una collaborazione è stata un'estensione naturale del lavoro di entrambi i laboratori.
"Nell'ingegneria delle cellule batteriche, sei costantemente al tiro alla fune, " ha detto Jewett. "Stai introducendo un meccanismo o una capacità che interessa a te come scienziato, ma quello che la cellula sta cercando di fare per se stessa è crescere e sopravvivere."
Per il loro nuovo metodo, il team ha preparato estratti cellulari da un ceppo di laboratorio ottimizzato di E. coli, CLM24, che sono stati selettivamente arricchiti con componenti chiave di glicosilazione. Gli estratti risultanti hanno consentito uno schema di reazione semplificato, che il team ha soprannominato sintesi glicoproteica priva di cellule (CFGpS).
"Un importante progresso di questo lavoro è che i nostri estratti privi di cellule contengono tutti i macchinari molecolari per la sintesi proteica e la glicosilazione proteica, " Stark ha detto. "Ciò significa che devi solo aggiungere le istruzioni del DNA per la tua proteina di interesse per creare una glicoproteina in CFGpS. Questa è una drastica semplificazione rispetto ai metodi basati sulle cellule e ci consente di produrre sofisticate molecole di glicoproteina in meno di un giorno".
E il metodo CFGpS è altamente modulare, consentendo l'uso di estratti distinti e diversi da miscelare per la produzione di una varietà di glicoproteine.
"Poiché abbiamo scelto E. coli, che manca di un proprio meccanismo di glicosilazione, per costruire la nostra piattaforma CFGpS, ci ha dato una tabula rasa per l'ingegneria dal basso verso l'alto di qualsiasi sistema di glicosilazione desiderato, " Ha detto Jaroentomeechai. "Questo ci dà la capacità unica di controllare le strutture dei carboidrati e la purezza delle glicoproteine a livelli che non sono attualmente ottenibili in altri sistemi di espressione basati su cellule".
Anche nei paesi sviluppati come gli Stati Uniti, il passaggio alla medicina personalizzata rende attraente questo tipo di protocollo di produzione di farmaci su richiesta. "Potresti usare una provetta invece di una 50, bioreattore da 000 litri per realizzare il tuo prodotto, che apre le porte a un paradigma di bioproduzione personalizzato in cui ogni paziente può ricevere un medicinale proteico unico su misura per la sua fisiologia, " Egli ha detto.
