Per la prima volta, gli scienziati della School of Molecular Sciences dell'ASU in collaborazione con i colleghi dell'Albert Einstein College of Medicine di New York City hanno catturato istantanee delle strutture cristalline degli intermedi nel percorso biochimico che ci consente di respirare.

Pubblicato oggi in Atti dell'Accademia Nazionale delle Scienze —Istantanea di un intermedio dell'ossigeno nella reazione catalitica della citocromo c ossidasi—i loro risultati forniscono informazioni chiave sulla fase finale della respirazione aerobica.

"Ci vuole una squadra per condurre un esperimento così sofisticato, " spiega la professoressa associata di SMS Alexandra Ros che, insieme al suo studente laureato Austin Echelmeier e all'ex stagista Gerrit Brehm, ha sviluppato il miscelatore di focalizzazione idrodinamica rendendo possibili questi esperimenti.

Il mixer è un dispositivo microfluidico, che è ad alta risoluzione, Stampato in 3D e consente a due flussi di tampone saturo di ossigeno di mescolarsi perfettamente con un flusso centrale contenente microcristalli di citocromo c ossidasi bovina (bCcO). Questo avvia una reazione catalitica tra l'ossigeno e i microcristalli.

All'inizio

Questa ricerca è stata avviata da una conversazione tra la professoressa di SMS Petra Fromme, direttore del Centro per la scoperta strutturale applicata (CASD) del Biodesign Institute, Raimund Fromme, Professore associato di ricerca SMS, e il professor Denis Rousseau dell'Albert Einstein College of Medicine di New York City che lavora sulla struttura della citocromo c ossidasi, un enzima chiave coinvolto nella respirazione aerobica.

La citocromo c ossidasi (CcO) è l'ultimo enzima nella catena respiratoria di trasporto degli elettroni delle cellule situate nella membrana mitocondriale. Riceve un elettrone da ciascuna delle quattro molecole di citocromo c, e li trasferisce a una molecola di ossigeno (due atomi), convertire l'ossigeno molecolare in due molecole di acqua.

I ricercatori del CASD, tra cui il professore di fisica Richard Snell dell'ASU, John Spence, ha contribuito a creare una nuova tecnica chiamata cristallografia seriale a femtosecondi (milionesimo di miliardesimo di secondo) risolta nel tempo (TR-SFX). Questa tecnica sfrutta un laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL) presso il Laboratorio nazionale dell'acceleratore SLAC del Dipartimento dell'energia (DOE), Stanford.

SFX è una tecnica promettente per la determinazione della struttura delle proteine, dove un flusso liquido contenente cristalli proteici viene intersecato con un raggio XFEL ad alta intensità che è un miliardo di volte più luminoso delle tradizionali sorgenti di raggi X di sincrotrone.

Mentre i cristalli si diffrangono e subito dopo vengono distrutti dall'intenso raggio XFEL, i modelli di diffrazione risultanti possono essere registrati con rivelatori all'avanguardia. Sono stati sviluppati nuovi potenti metodi di analisi dei dati, consentendo a un team di analizzare questi modelli di diffrazione e ottenere mappe di densità elettronica e informazioni strutturali dettagliate delle proteine.

Il metodo è particolarmente interessante per le proteine ​​difficili da cristallizzare, come proteine ​​di membrana, poiché fornisce informazioni strutturali ad alta risoluzione da piccoli micro o nanocristalli, riducendo così il contributo dei difetti cristallini ed evitando la tediosa (se non impossibile) crescita di grandi cristalli come è richiesto nella cristallografia tradizionale a base di sincrotrone.

Questo nuovo metodo di "diffrazione prima della distruzione" ha aperto nuove strade per la determinazione strutturale di biomolecole fragili in condizioni fisiologicamente rilevanti (a temperatura ambiente e in assenza di crioprotettori) e senza danni da radiazioni.

CcO riduce l'ossigeno in acqua e sfrutta l'energia chimica per guidare il riposizionamento del protone (atomo di idrogeno caricato positivamente) attraverso la membrana mitocondriale interna mediante un meccanismo precedentemente irrisolto.

In sintesi, gli studi TR-SFX hanno permesso la determinazione strutturale di un intermedio chiave dell'ossigeno di bCcO. I risultati degli esperimenti del team forniscono nuove informazioni sul meccanismo di rilocazione dei protoni nell'enzima della mucca rispetto a quello nei CcO batterici, e apre la strada alla determinazione delle strutture di altri intermedi CcO, così come specie transitorie formate in altre reazioni enzimatiche.