Le tecniche dei neutroni sono utili per studiare gli atomi leggeri come l'idrogeno, ottime per le molecole biologiche che ne contengono un gran numero. I neutroni sono particolarmente sensibili alla sostituzione isotopica dell'idrogeno (1H) con il deuterio (2H) e questo permette di utilizzare tecniche di contrasto per studiare le molecole in dettaglio. Per questo, gli utenti devono preparare versioni deuterate delle molecole biologiche che vogliono studiare. Però, queste molecole per-deuterate sono raramente disponibili da fornitori commerciali perché il loro mercato ha un valore limitato. Qui SINE2020 mira a colmare il divario.

L'attività 5.2 del pacchetto di lavoro sulla deuterazione chimica consiste nell'impostare le procedure per l'estrazione, purificazione e analisi di piccole biomolecole deuterate. Queste molecole saranno quindi disponibili per gli utenti delle tecniche dei neutroni e tramite i partner della piattaforma DEUNET. Le principali biomolecole coinvolte sono i fosfolipidi, steroli (ad es. colesterolo) e sfingolipidi, tutti i tipi di molecole che si possono trovare nelle membrane biologiche e quindi hanno importanti applicazioni nei prodotti farmaceutici. I lipidi hanno ruoli anche nei cosmetici, alimentare e delle nanotecnologie, quindi la capacità di studiarli usando i neutroni sarebbe preziosa per molti ricercatori e aziende industriali.

Krishna Batchu, con Giovanna Fragneto, all'ILL sta svolgendo la ricerca per SINE2020. Il lavoro si è concentrato su vari fosfolipidi che includono principalmente fosfatidiletanolammina (PE), fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilserina (PS). Sono preparati utilizzando colture cellulari del ceppo di lievito Pichia pastoris poiché funziona bene per l'estrazione dei lipidi e cresce con successo in terreni deuterati.

I fosfolipidi sono molecole anfipatiche che consistono in un gruppo di testa che ama l'acqua e due "gambe" che odiano l'acqua. Le "gambe" sono catene di atomi di carbonio attaccati all'idrogeno (o atomi di deuterio). Le loro composizioni nelle membrane cellulari sono enormemente complesse con membrane che tipicamente comprendono diverse migliaia di specie molecolari di lipidi chimicamente distinte. Le catene all'interno possono variare in lunghezza, solitamente da 6 a 24 atomi di carbonio, e contengono da 0 a 12 doppi legami tra gli atomi di carbonio, il cosiddetto livello di saturazione. Più doppi legami, quanto più insatura è la catena.

L'omeostasi dei fosfolipidi in un sistema biologico è mantenuta attraverso tre processi cellulari chiave:1) Biosintesi 2) Rimodellamento e 3) Degradazione. Nelle cellule di lievito (nella coltura) esiste un macchinario molecolare dedicato per il metabolismo degli acidi grassi che causa sia l'allungamento che l'insaturazione della catena, catalizzate rispettivamente da allungamenti e desaturasi, durante il processo produttivo. Una volta biosintetizzato, la loro incorporazione in vari fosfolipidi è catalizzata da un certo numero di aciltransferasi portando così all'esistenza di un più ampio repertorio di singole specie molecolari. La sfida è che con così tante variabili il numero di tipi di fosfolipidi prodotti è vasto.

Parte del progetto ha studiato come le condizioni di crescita influenzano il tipo di lipidi prodotti. Non sono state riscontrate differenze significative che suggeriscano che il tempo di raccolta influenzi il profilo lipidico, ma vi sono alcune indicazioni che la fonte di carbonio abbia un effetto e che si verifichi una maggiore insaturazione se la crescita avviene a temperature più basse.

Una volta che una coltura cellulare è cresciuta, i lipidi devono essere estratti, separato e purificato. Questo è stato raggiunto, per PC sia idrogenato che deuterato, molecole di PS e PE, utilizzando un processo in due fasi:un'estrazione in fase solida seguita da purificazione tramite una colonna in fase normale accoppiata a un sistema HPLC. Sono state preparate versioni idrogenate per confrontarle con le specie deuterate e per testare inizialmente i processi per evitare lo spreco di deuterio costoso.

Ora la sfida è purificare le singole specie molecolari, identificarli e analizzarli utilizzando un approccio spettrometrico di massa. L'obiettivo finale è documentare attentamente tutte le procedure ei protocolli per la produzione di queste biomolecole deuterate per i futuri utenti.