L'etichettatura di spin site-directed (SDSL) utilizzata in combinazione con la spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è stata una tecnica collaudata e affidabile per chiarire la struttura, funzione e dinamica delle proteine ​​e dei complessi proteici. Le etichette spin a base di nitrossido sono tra le più popolari e affermate perché sono piccole, non disturbano e presentano eccellenti proprietà spettroscopiche. "Le procedure di etichettatura di spin ideali mostrano elevate velocità di reazione e selettività, " spiega il professor Malte Drescher, Professore di spettroscopia dei sistemi complessi presso il Dipartimento di Chimica dell'Università di Costanza e autore principale dello studio insieme al professor Valentin Wittmann, specializzato in sintesi organica.

"Raggiungere un'elevata reattività e un'elevata selettività allo stesso tempo può essere un problema, " continua Drescher. "Etichette di spin convenzionali basate, ad esempio, su Gadolinio(III) o tritile, mostrano spettri molto ampi e basse profondità di modulazione o spettri molto stretti che non sono adatti per i tipi di esperimenti che vogliamo condurre." Un nuovo studio pubblicato da Drescher, Wittmann e il loro team di chimici dell'Università di Costanza, che è stato pubblicato online sulla rivista Comunicazioni ChemBioChem il 14 agosto 2019, introduce un nuovo approccio per l'etichettatura delle proteine ​​che presenta etichette di spin a base di nitrossido e aminoacidi non canonici geneticamente codificati (ncAA) come bersagli per SDSL.

"I nitrossidi forniscono un'ampiezza spettrale ideale e l'accesso a informazioni dinamiche, "dice Anandi Kugele, un ricercatore di dottorato presso la Konstanz Research School of Chemical Biology (KoRS-CB) e primo autore dello studio, che ha ricevuto una prestigiosa borsa di studio dal National High Magnetic Field Laboratory per presentare i risultati alla Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance del 2019 a Denver, Colorado (Stati Uniti). "Le etichette tradizionali a base di nitrossido hanno una stabilità redox limitata, che è uno svantaggio per le applicazioni in-cell. La sfida per noi era aumentare la stabilità del nitrossido e quindi adattare le etichette di spin a base di nitrossido per l'uso futuro di routine in vivo." A tal fine, i ricercatori hanno sviluppato una nuova etichetta di spin che può essere attaccata alle proteine ​​mediante cicloaddizione Diels-Alder (DAinv) a domanda di elettroni inversa a ncAA geneticamente codificati, un metodo che si è dimostrato adatto a un'ampia gamma di applicazioni in vitro e in vivo. Per ottenere la stabilità del nitrossido, i ricercatori hanno inoltre utilizzato una strategia di protezione basata su gruppi protettivi fotorimovibili, che sono noti per proteggere i nitrossidi e rilasciarli secondo necessità.

La nuova etichetta di spin, denominata nitrossido fotoattivabile per la reazione DAinv, o Panda in breve:è solubile in acqua, EPR-attivo ed efficiente nella deprotezione come test sia in vitro che in lisato con le due proteine ​​modello Green Fluorescent Protein (GFP) e Escherichia coli ossidoreduttasi tioredossina (TRX), che si trova praticamente in tutti gli organismi conosciuti, suggerire. "Dobbiamo migliorare il metodo utilizzato per fornire l'etichetta di rotazione PaNDA alle cellule e per testare l'efficienza di etichettatura e deprotezione all'interno della cellula, tra le altre cose, " conclude Malte Drescher:"Ma la nostra ricerca dimostra chiaramente che, in linea di principio, l'etichetta PaNDA può essere utilizzata per misurazioni EPR in ambienti biologici difficili, compreso l'interno delle cellule. I nostri test con il lisato di E. coli sono molto promettenti in questo senso. Ciò aprirà una gamma completamente nuova di opportunità per lo studio delle proteine ​​mediante spettroscopia EPR".