Il numero di proteine ​​nel corpo umano, noto collettivamente come il proteoma, è vasto. Da qualche parte tra gli 80, 000 e 400, 000 proteine ​​circolano nelle nostre cellule, tessuti e organi, svolgere una vasta gamma di compiti essenziali per la vita. Quando le proteine ​​vanno storte, sono responsabili di una miriade di gravi malattie.

Ora, ricercatori del Biodesign Center for Applied Structural Discovery e della School of Molecular Sciences dell'ASU, insieme ai loro colleghi, studiare una classe di proteine ​​di importanza critica, che adornano le membrane esterne delle cellule. Tali proteine ​​di membrana agiscono spesso come recettori per le molecole di legame, avviare segnali che possono alterare il comportamento cellulare in vari modi.

Nel nuovo studio è descritto un nuovo approccio all'acquisizione di dati strutturali delle proteine ​​di membrana con dettagli sorprendenti. Metodi di microscopia elettronica criogenica (o crio-EM), una rivoluzionaria suite di strumenti, viene utilizzato. Ulteriore, l'uso della cosiddetta cristallizzazione LCP e della diffrazione elettronica da microcristalli (MicroED) aiuta a svelare dettagli strutturali delle proteine ​​che sono stati in gran parte inaccessibili attraverso approcci convenzionali come la cristallografia a raggi X.

I risultati descrivono il primo utilizzo di microcristalli incorporati in LCP per rivelare dettagli strutturali della proteina ad alta risoluzione utilizzando MicroED. La nuova ricerca abbellisce la copertina dell'attuale numero della rivista Cell Press Struttura .

"LCP è stato un grande successo nella cristallizzazione delle proteine ​​di membrana, secondo Wei Liu, un autore corrispondente del nuovo studio. "La nuova ampia applicazione di LCP-MicroED offre la promessa di approcci migliorati per la determinazione strutturale da bersagli proteici impegnativi. Questi progetti strutturali possono essere utilizzati per facilitare la progettazione di nuovi farmaci terapeutici da intuizioni più precise".

Una classe di proteine ​​di membrana di particolare interesse sono i recettori accoppiati a proteine ​​G (GPCR), che formano il gruppo più ampio e vario di recettori di membrana presenti negli organismi eucarioti, compresi gli umani.

Le attività fisiologiche dei GPCR sono così importanti da costituire un obiettivo importante per un'ampia gamma di farmaci terapeutici. È qui però che sorgono i problemi, poiché determinare la struttura dettagliata delle proteine ​​di membrana, un precursore essenziale per un'accurata progettazione di farmaci, pone spesso enormi sfide.

La tecnica della cristallografia a raggi X è stata utilizzata per studiare le strutture su scala atomica e persino il comportamento dinamico di molte proteine. Qui, campioni cristallizzati della proteina in esame vengono colpiti con un raggio di raggi X, causando modelli di diffrazione, che appaiono su uno schermo. L'assemblaggio di migliaia di istantanee di diffrazione consente di assemblare un'immagine strutturale 3D ad alta risoluzione con l'ausilio di computer.

Eppure molte proteine ​​di membrana, compresi GPCR, non formare grandi, cristalli ben ordinati appropriati per la cristallografia a raggi X. Ulteriore, tali proteine ​​sono delicate e facilmente danneggiabili dai raggi X. Per aggirare il problema è stato necessario l'uso di dispositivi speciali noti come laser a elettroni liberi a raggi X o XFELS, che può fornire una brillante esplosione di raggi X della durata di pochi femtosecondi, (un femtosecondo è pari a un quadrilionesimo di secondo o circa il tempo impiegato da un raggio di luce per attraversare il diametro di un virus). La tecnica della cristallografia a raggi X a femtosecondi seriale consente ai ricercatori di ottenere un'immagine di rifrazione prima che il campione cristallizzato venga distrutto.

Tuttavia, la cristallizzazione di molte proteine ​​di membrana rimane un'arte estremamente difficile e imprecisa e solo una manciata di queste gigantesche macchine XFEL esistono nel mondo.

Inserisci la microscopia elettronica criogenica e MicroED. Questa tecnica innovativa prevede il congelamento rapido di cristalli proteici in una sottile patina di ghiaccio, poi sottoponendoli a un fascio di elettroni. Come nel caso della cristallografia a raggi X, il metodo utilizza modelli di diffrazione, questa volta dagli elettroni piuttosto che dai raggi X, per assemblare le strutture dettagliate finali.

MicroED eccelle nella raccolta di dati da cristalli troppo piccoli e irregolari per essere utilizzati per la cristallografia a raggi X convenzionale. Nel nuovo studio, i ricercatori hanno utilizzato due tecniche avanzate in tandem per produrre immagini di diffrazione ad alta risoluzione di due importanti proteine ​​modello:la proteinasi K e il recettore dell'adenosina A2A, le cui funzioni includono la modulazione dei neurotrasmettitori nel cervello, vasodilatazione cardiaca e risposta immunitaria delle cellule T.

Le proteine ​​sono state incorporate in un tipo speciale di cristallo noto come fase cubica lipidica o cristallo LCP, che imita l'ambiente nativo in cui tali proteine ​​si trovano naturalmente. I campioni LCP sono stati quindi sottoposti a microscopia elettronica, utilizzando il metodo MicroED, che consente l'acquisizione di immagini estremamente sottili, cristalli di dimensioni inferiori al micron. Ulteriore, la rotazione continua dei cristalli LCP al microscopio elettronico consente di acquisire più modelli di diffrazione da un singolo cristallo con un valore estremamente basso, dose di elettroni senza danni.

La capacità di esaminare proteine ​​che possono formare solo micro o nanocristalli apre la porta alla determinazione strutturale di molte proteine ​​di membrana di vitale importanza che hanno eluso i mezzi di indagine convenzionali, in particolare GPCR.