Figura 1:(a) Schizzo esplicativo del nanosensore ancorato alla membrana plasmatica. I composti utilizzati per la coniugazione delle nanoparticelle d'oro (AuNP) sono il 4-mercaptofenilboronico pinacol estere (4MPBE) sensibile all'H2O2 e la biotina-HPDP. La biotinilazione degli ectdomini della proteina di membrana plasmatica è ottenuta utilizzando NHS-Biotin. L'ancoraggio del coniugato AuNP e NHS-Biotina è dato dalla streptavidina che reagisce con le due porzioni di biotina. (b) L'analisi AFM è stata eseguita su cellule di cancro al polmone A549 dopo l'ancoraggio e la fissazione del nanosensore. Le immagini AFM ad alta risoluzione hanno confermato la presenza del nanosensore, che è in contatto con la superficie cellulare ed è in grado di rilevare H2O2 endogeno in una regione molto superficiale (cioè, 90 nm) del fluido extracellulare a contatto con la membrana plasmatica. Credito:Università di Kanazawa
I ricercatori dell'Università di Kanazawa riferiscono in Biosensori e Bioelettronica un test riuscito di un sensore per misurare le concentrazioni di perossido di idrogeno vicino alle membrane cellulari. Il sensore ha il potenziale per diventare uno strumento per nuove terapie contro il cancro.
Diversi processi nel corpo umano sono regolati da reazioni biochimiche che coinvolgono il perossido di idrogeno (H 2 oh 2 ). Sebbene possa fungere da "messaggero secondario, "trasmettere o amplificare determinati segnali tra le cellule, h 2 oh 2 è generalmente tossico a causa del suo carattere ossidante. Quest'ultimo significa che converte (ossida) molecole biochimiche come proteine e DNA. La proprietà ossidante di H 2 oh 2 è di potenziale rilevanza terapeutica per il cancro, però:inducendo deliberatamente le cellule tumorali ad aumentare il loro H 2 oh 2 la concentrazione sarebbe un modo per distruggerli. Alla luce di questo, ma anche per il monitoraggio di patologie associate a H 2 oh 2 sovrapproduzione, è fondamentale disporre di un mezzo per quantificare in modo affidabile le concentrazioni di perossido di idrogeno nell'ambiente extracellulare. Ora, Leonardo Pupulin del Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), Kanazawa University e colleghi hanno sviluppato un sensore per misurare le concentrazioni di H 2 oh 2 in prossimità delle membrane cellulari, con risoluzione nanometrica.
Il biosensore è costituito da una nanoparticella d'oro con molecole organiche attaccate ad essa. L'intero cluster è progettato in modo da ancorarsi facilmente all'esterno della membrana di una cellula, che è esattamente dove si trovano le molecole di perossido di idrogeno da rilevare. Come molecole di attaccamento, gli scienziati hanno usato un composto chiamato 4MPBE, noto per avere una forte risposta di dispersione Raman:quando irradiato da un laser, le molecole consumano parte dell'energia della luce laser. Misurando la variazione di frequenza della luce laser, e tracciando la potenza del segnale in funzione di questo cambiamento, si ottiene uno spettro unico, una firma delle molecole 4MPBE. Quando una molecola 4MPBE reagisce con un H 2 oh 2 molecola, il suo spettro Raman cambia. Sulla base di questo principio, confrontando gli spettri Raman, Pupulin e colleghi sono stati in grado di ottenere una stima dell'H 2 oh 2 concentrazione vicino al biosensore.
Figura 2:(a) La spettroscopia Raman con superficie migliorata è stata utilizzata per rilevare e quantificare la modifica indotta da H2O2 di molecole 4MPBE assemblate sulla superficie dorata del nanosensore ancorato alle cellule. L'intensità della banda Raman a 998 cm-1 dipende dalla concentrazione di H2O2, mentre la banda a 1074 cm-1 non ha mostrato modifiche e può essere utilizzata per la normalizzazione delle righe spettrali. (b) Risultati della calibrazione del nanosensore. Il rapporto tra l'intensità a 1074 cm-1 e l'intensità a 998 cm-1 ha mostrato una dipendenza lineare rispetto alla concentrazione di H2O2. (c) Esempio di mappa iperspettrale SERS di H2O2 endogeno extracellulare raccolto dalla superficie della cellula A549 mostrata nella immagine in campo chiaro. Gli spettri SERS mostrati in (a) sono stati raccolti dalle posizioni A e B. Credito:Kanazawa University
Dopo aver sviluppato una procedura di calibrazione per il loro nanosensore, relativo all'H 2 oh 2 concentrazione a un cambiamento nello spettro Raman in modo quantitativo non è semplice:gli scienziati sono stati in grado di produrre una mappa di concentrazione con una risoluzione di circa 700 nm per campioni di cellule di cancro ai polmoni. Finalmente, sono anche riusciti ad estendere la loro tecnica per ottenere misure di H 2 oh 2 variazione di concentrazione attraverso le membrane cellulari.
Puppulin e colleghi concludono che il loro "nuovo approccio può essere utile per lo studio dell'H . effettivo". 2 oh 2 concentrazioni coinvolte nella proliferazione o morte cellulare, che sono fondamentali per chiarire pienamente i processi fisiologici e per progettare nuove strategie terapeutiche".
Figura 3:(a) Schema esplicativo della produzione extracellulare di H2O2 da parte del complesso NOX, il conseguente assorbimento attraverso il canale dell'Acquaporina e la reazione con la perossiredossina intracellulare. In condizioni stazionarie, il rapporto di concentrazione di H2O2 extracellulare su H2O2 intracellulare può essere stimato dal rapporto tra la costante di velocità di riduzione di H2O2 da parte della perossiredossina (kprx) e la costante di velocità di assorbimento di H2O2 attraverso la membrana plasmatica (kabs). (b)-(c) Risultati tipici di esperimenti di biologia redox con linee di adattamento da cui abbiamo misurato kabs e kprx, rispettivamente. (d) Superficie extracellulare media [H2O2]e e il massimo tipico di [H2O2]e misurato su cellule A549 utilizzando il nanosensore di nuova concezione. (e) Media intracellulare di [H2O2]i e massimo tipico di [H2O2]i stimato su cellule A549 secondo il modello riportato in (a) e utilizzando i risultati di (b)-(d). Credito:Università di Kanazawa
Il biosensore sviluppato da Leonardo Puppulin dell'Università di Kanazawa e colleghi si basa su un metodo chiamato spettroscopia Raman con superficie potenziata (SERS). Il principio deriva dalla spettroscopia Raman, in cui vengono analizzate le differenze tra le frequenze in entrata e in uscita della luce laser irradiata su un campione. Lo spettro ottenuto tracciando la potenza del segnale in funzione della differenza di frequenza è caratteristico per il campione, che in linea di principio può essere una singola molecola. Tipicamente, però, il segnale proveniente da una molecola è troppo debole per essere rilevato, ma l'effetto può essere potenziato quando la molecola viene assorbita su una superficie metallica ruvida. Pupulin e colleghi hanno applicato la tecnica per rilevare (indirettamente) il perossido di idrogeno; la loro molecola sensibile al Raman è un composto chiamato 4MPBE, che viene modificato quando esposto al perossido di idrogeno.
