Misurazioni accurate dell'intensità della luce forniscono dati vitali per gli scienziati e per le applicazioni quotidiane. Ad esempio, valori precisi aiutano a ottimizzare i segnali microscopici, ad attivare processi fisiologici nel cervello e a stimolare reazioni di assorbimento della luce, consentendo al tempo stesso a diversi team di ricerca di condividere e riprodurre risultati sperimentali.
"Oggi, una vasta comunità di biologi, chimici, ingegneri e fisici si preoccupa di fornire numeri precisi di fotoni", spiega un gruppo di ricerca il cui lavoro è stato appena pubblicato su Nature Methods . Su scala più ampia, la precisione è essenziale anche per attività critiche come la depurazione dell'acqua e la fototerapia.
Tuttavia, la maggior parte degli approcci manca di versatilità e usabilità. Ad esempio, la maggior parte dei metodi non è in grado di quantificare simultaneamente l'intensità della luce e la distribuzione spaziale o può farlo solo attraverso una gamma limitata di lunghezze d'onda e intensità della luce.
Per fornire un’alternativa versatile alle limitazioni degli approcci attuali, il gruppo di ricerca ha sviluppato due protocolli complementari utilizzando nuovi attinometri:sistemi fisici o chimici in grado di quantificare i fotoni. Trattandosi di soluzioni liquide, gli attinometri possono essere utilizzati in campioni di diverse forme e dimensioni. Tuttavia, la maggior parte non è molto precisa o compatibile con i sistemi di imaging e di solito è limitata a lunghezze d'onda e intensità di luce specifiche.
Per superare queste limitazioni, il team ha utilizzato attinometri basati sulla fluorescenza, che si sono rivelati più veloci, più sensibili e in grado di fornire dati più accessibili ai sistemi di imaging.
Il primo protocollo utilizza cinque attinometri molecolari, che coprono l’intero spettro della luce ultravioletta e visibile, che emettono segnali fluorescenti quando assorbono la luce di eccitazione che i ricercatori vogliono misurare. In determinate condizioni, questo protocollo può anche mappare la distribuzione spaziale dell'intensità della luce. Il team ha testato diversi tipi di attinometri, dai prodotti chimici di sintesi per i chimici alle proteine e agli organismi fotosintetici per i biologi.
"Volevamo rendere gli attinometri fluorescenti accessibili a diverse comunità di utenti finali", affermano i ricercatori.
Il secondo protocollo integra gli attinometri fluorescenti del primo, perché a causa dei loro intervalli limitati di assorbimento della luce, sono necessari diversi attinometri per coprire l'intera gamma di lunghezze d'onda. Questo protocollo utilizza un fluoroforo stabile, una sostanza chimica in grado di riemettere luce in seguito all'eccitazione della luce, per calcolare all'indietro l'intensità della luce da una lunghezza d'onda a un'altra.
"Insieme, i due nuovi protocolli possono essere utilizzati in situazioni di luce debole, per periodi più brevi e in una gamma più ampia di lunghezze d'onda rispetto ai metodi convenzionali", afferma il gruppo.
Il gruppo di ricerca ha applicato con successo i protocolli per caratterizzare la distribuzione spaziale della luce in diversi sistemi di imaging a fluorescenza, dimostrandone la versatilità e l'accuratezza. I protocolli sono stati utilizzati anche per calibrare l'illuminazione in strumenti e sorgenti luminose disponibili in commercio.
Questi protocolli potrebbero essere applicati alla microscopia ad ampio campo e confocale, consentendo la misurazione precisa dell'intensità della luce nei campioni biologici. Il team afferma:"Prevediamo che [i nostri protocolli] miglioreranno la nostra comprensione di come la luce influisce sulla salute e sulla vitalità dei campioni biologici". È possibile studiare anche ambienti complessi, come all'interno dei gel o nelle profondità dei tessuti, una caratteristica essenziale per DREAM nella sua missione di registrare le dinamiche di regolazione della fotosintesi nelle microalghe o nelle piante.
L’introduzione di questi metodi di actinometria basati sulla fluorescenza rappresenta un significativo passo avanti nella misurazione accurata dell’intensità della luce. Con l'accesso online alle proprietà dell'attinometro e alle applicazioni di elaborazione dati di facile utilizzo, ricercatori e ingegneri dovrebbero ora essere in grado di misurare con precisione l'intensità della luce e condividere dati affidabili e riproducibili tra le discipline.
Ulteriori informazioni: Aliénor Lahlou et al, Fluorescenza per misurare l'intensità della luce, Metodi naturali (2023). DOI:10.1038/s41592-023-02063-y
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